神经丝轻链蛋白的暴露会通过p38/MK2/NF-κB/CREB1/Nrf2/HO-1信号通路促进蛋白质聚集、小胶质细胞增生、星形胶质细胞增生以及神经炎症，进而引发帕金森病
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NfL蛋白主动参与帕金森病进展，通过动物模型和AFM证实其聚集形态可诱导运动障碍、神经炎症及氧化应激，并激活p38/MK2/NF-κB/CREB1通路，导致多巴胺能神经元损伤。
安朱曼·南达（Anjuman Nanda）、希瓦姆·库马尔·潘迪（Shivam Kumar Pandey）和拉凯什·库马尔·辛格（Rakesh Kumar Singh）
印度北方邦卢克瑙（Lucknow）萨拉吉尼纳加尔（Sarojini Nagar）比杰努尔-西森迪路（Bijnour-sisendi Road）的拉埃巴雷利（Raebareli）国家制药教育与研究学院（National Institute of Pharmaceutical Education and Research, NIPER）药物学与毒理学系，邮编226002。
摘要
神经丝轻链（NfL）是一种公认的生物标志物，可用于检测多种神经退行性疾病（包括帕金森病（PD）中神经元结构的完整性。本研究通过将其效应与6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的小鼠模型进行比较，探讨了NfL蛋白如何主动促进PD的进展。我们使用原子力显微镜（AFM）观察注射前NfL的聚集情况和纤维形态，并监测了注射后第0天、第14天和第28天动物的运动能力、协调性和认知能力。同时，我们评估了多种分子生化变化，包括促炎蛋白和凋亡蛋白的表达、多巴胺转运蛋白（DAT）的表达、神经元核标记物（NeuN）以及胶质增生标记物（GFAP和IBA-1）的表达，以及酪氨酸羟化酶（TH）和α-突触核蛋白（α-synuclein）的共定位，以评估手术第28天大脑纹状体（striatum）和黑质致密部（SNpc）区域的多巴胺能病理特征。
NfL暴露导致动物运动能力显著下降，出现类似焦虑的症状，并且认知行为减弱。我们发现TH水平显著降低，同时α-突触核蛋白积累增加。此外，这两个区域的多巴胺转运蛋白（DAT）和神经元核抗原（NeuN）表达也有所减少。NfL暴露还以剂量依赖的方式损害了氧化平衡，激活了促炎生物标志物并引发了胶质增生。
这项研究直接证明了NfL暴露及其体内聚集的病理作用，为理解NfL在动物体内诱导PD进展的机制提供了新的见解。
引言
帕金森病（PD）的特点是多巴胺能神经元的逐渐丧失、异常的路易小体（Lewy bodies）在纹状体和黑质致密部（SNpc）区域的积累以及神经炎症[1]、[2]。慢性神经炎症导致的神经元损伤会使多种神经元成分释放到细胞外空间，如脑脊液（CSF）[3]和血液[4]中。脑脊液和血液中高水平的神经元特异性细胞骨架标志物（尤其是神经丝轻链（NfL）是临床前[5]和临床[7]、[8] PD模型中轴突损伤的可靠指标。因此，NfL可作为监测PD早期神经轴突退化的敏感标志物[9]、[10]、[11]。
NfL是一种特异存在于神经元中的中间丝，与微管和肌动蛋白一起构成神经元细胞骨架[12]。编码NfL的NEFL基因发生转基因突变会导致人类和动物出现多种疾病[13]、[14]，包括夏科-马里-图斯病（Charcot-Marie-Tooth disease, CMT）[15]、肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）[16]和阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）[17]，表明其在这些疾病进展中的关键作用。值得注意的是，NfL敲除（KO）小鼠在多种神经退行性疾病中表现出轴突直径增大和运动缺陷减少[18]、[19]。NEFL基因还与ALS模型中的动物存活率提高及疾病发作延迟有关[20]。尽管经过数十年的研究，细胞外NfL释放的机制及其对周围神经胶质细胞的影响仍很大程度上未被探索。
NfL已成为轴突损伤的关键生物标志物，并与人类PD病情恶化直接相关，这表明细胞外NfL本身可能参与神经退行性过程。因此，我们假设NfL不仅仅是轴突损伤的被动指标，还可能主动参与神经退行性过程。在临床前模型中，PD中的神经元损伤会通过钙蛋白酶（calpain）驱动的酶促过程释放出特定的NfL片段，从而激活小胶质细胞和巨噬细胞[21]。另有研究表明，脑室内注射6-羟基多巴胺（6-OHDA）会导致纹状体区域NfL积累并伴随运动障碍[22]。这提示直接外源性给予NfL也可能引发神经元变化，类似于已建立的6-OHDA模型，从而验证了NfL作为PD主要病理介质的作用。基于此，我们通过将外源性聚集的NfL肽注入动物大脑的纹状体区域来评估各种神经炎症和神经退行性事件。
细胞对压力和炎症的反应中，p38 MAPK通路起着关键作用[23]、[24]。其下游效应分子MAPK-激活的蛋白激酶2（MK2）[25]、核因子-κB（NF-κB）通路[26]、[27]和环腺苷酸反应元件结合蛋白1（CREB1）[28]、[29]在调节炎症反应和神经保护中起着核心作用。p38 MAPK的激活或磷酸化在许多神经退行性疾病中会导致神经元死亡[30]，而细胞外NfL肽的存在可能会加剧这一过程。此外，NF-κB通路通过调控与炎症、细胞存活和凋亡相关的基因，在NfL介导的神经毒性中起着关键作用[31]。CREB1在调节神经元存活、突触可塑性和抗炎过程中也起着重要作用，但在PD中常常被失活[32]。p38/MK2/NF-κB/CREB1的异常激活与炎症加剧、神经毒性和神经退行性变化有关。
本研究使用重组NfL肽作为主要诱导剂，探讨其在PD中的病理作用。注射前我们通过原子力显微镜（AFM）确认了NfL的聚集形式。利用立体定向装置将聚集的NfL通过纹状体内注射方式注入动物的大脑特定区域。最新文献显示，转基因PD模型中脑脊液中的NfL病理水平可能在200,000–600,000 pg/ml之间[33]、[34]。据此，我们选择了两种NfL蛋白剂量（0.8 ng/2 μl或400,000 pg/ml）和（8 ng/2 μl或4,000,000 pg/ml），以模拟动物大脑中NfL蛋白水平升高的病理情况[35]、[36]。
为了验证NfL蛋白的致病潜力，我们使用了广泛认可的6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导模型进行对比，因为该模型具有选择性的多巴胺能神经退行性变化、运动缺陷和相关的神经炎症。此外，我们还检测了胶质增生标志物、紧密连接标志物、抗氧化蛋白以及p38/MK2/NF-κB/CREB1/Nrf2/HO-1通路，以了解其在PD病理中的潜在作用。本研究清楚地表明NfL如何主动促进神经炎症级联反应和神经退行性变化，从而导致动物PD的病理进展。这是首个在临床前模型中证明单侧给予NfL能有效再现PD关键病理特征的研究报告。
化学物质和试剂
重组人NfL蛋白（编号9715NF050）购自R&D Systems，并按照制造商的说明进行重组。对于纹状体内注射，我们根据制造商的方案重新配制了重组NfL蛋白，并用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）稀释得到最终注射浓度（分别为400,000 pg/ml和4,000,000 pg/ml），每2 μl中含有0.8 ng和8 ng的NfL。
重组NfL蛋白的特性及其在大脑区域的表达
我们使用原子力显微镜（AFM）分析了重组NfL蛋白的超微结构组织，通过Western blotting检测了 sacrifice 后组织样本中的NfL表达水平。二维地形图（图2A）和相应的三维表面重建显示了云母表面存在有序的纤维结构。讨论
尽管神经丝轻链（NfL）是PD中神经元损伤的公认生物标志物，但其对疾病发病机制的主动贡献仍需进一步研究[56]、[57]。这是首项研究表明，在BALB/c小鼠中单侧给予NfL能有效再现PD的关键病理特征，包括运动和非运动认知缺陷、神经元退化、异常蛋白质聚集、神经炎症和氧化应激。
结论
总之，单侧给予NfL会导致运动和非运动认知行为缺陷、由于神经元损伤导致的多巴胺能完整性受损、通过p38/MK2/NF-κB/CREB1通路引发强烈的炎症信号传导、炎症细胞因子增加、氧化应激以及血脑屏障（BBB）完整性受损。这些发现强调了NfL在PD中的关键病理作用，表明针对NfL驱动的信号传导机制可能具有治疗潜力。
作者贡献声明
安朱曼·南达（Anjuman Nanda）： 数据可视化、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。希瓦姆·库马尔·潘迪（Shivam Kumar Pandey）： 方法学设计、实验研究、数据分析。拉凯什·库马尔·辛格（Rakesh Kumar Singh）： 文章撰写与审稿、初稿撰写、项目监督、软件使用、资源管理、资金筹集、概念构思。
致谢
本研究的必要基础设施和资金支持来自印度化学与化肥部（Ministry of Chemicals and Fertilizers）的制药部门。作者感谢拉埃巴雷利国家制药教育与研究学院（National Institute of Pharmaceutical Education and Research, Raebareli）的新药输送系统卓越中心以及印度化学与化肥部的制药部门对本研究的财务支持。
