光响应明胶水凝胶：用于调控细胞粘附的光可调细胞支架

《ACS Applied Bio Materials》：Phototunable Gelatin-Based Hydrogels as Cell Scaffolds for Modulating Cell Adhesion on Hydrogel Surfaces

本研究的核心在于设计并合成了一种光响应明胶丙烯酸酯水凝胶，旨在实现对细胞-材料相互作用的精细调控，为组织工程应用提供动态、可调的平台。通过引入光降解的邻硝基苄基丙烯酸酯（PDA）到明胶主链，该水凝胶在特定波长光照射下能发生可控降解，进而调节人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的粘附与铺展行为。这项研究证实了通过光刺激可以按需、精确地重塑细胞微环境，为发展可动态调控的生物制造技术与再生医学应用（如血管组织建模）提供了新策略。

　　

1. 1.
   引言
   细胞支架旨在模拟体内细胞外基质（ECM）等生物微环境。水凝胶因其高持水性和细胞包封能力而被广泛应用。立体光刻技术可以实现水凝胶的精准三维（3D）打印，以构建复杂的组织支架模型。为了克服传统3D水凝胶支架可调性有限的问题，光响应性水凝胶应运而生，其能够通过光照实现可控降解和性能调节。明胶作为一种源自胶原蛋白的天然聚合物，具有良好的生物相容性和细胞粘附能力，但其水凝胶在生理温度下通常不稳定。因此，常采用甲基丙烯酸酐改性明胶制成明胶甲基丙烯酸酯（GelMA），通过自由基聚合形成交联水凝胶。然而，一旦GelMA水凝胶模型打印完成，其物理性能和功能便基本固定，缺乏后续的可调性。为了解决这一问题，研究者开始关注光降解材料，其力学和化学性质可通过光照控制，为构建具有动态调控能力的组织工程平台提供了可能。本研究的目的是合成一种既保留类似GelMA的3D打印潜力，又允许后续可控降解的明胶基细胞支架水凝胶。
2. 2.
   实验步骤
   2.1. 试剂
   所有试剂均购自商业来源并直接使用，包括明胶、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）等。

2.2. 光降解明胶丙烯酸酯（Gelatin-PDA）的合成

参照先前报道的方法合成了邻硝基苄基丙烯酸酯。Gelatin-PDA的合成是通过明胶的氨基与邻硝基苄基丙烯酸酯的羧基，在EDC和NHS存在下进行偶联反应实现的。通过¹H NMR谱计算，PDA在明胶中的取代度为99%，表明几乎所有的赖氨酸氨基都已与PDA反应。通过紫外-可见光谱评估了Gelatin-PDA水溶液在光照下的降解行为，其最大吸收波长随照射时间（0至180分钟）从349 nm逐渐降低至316 nm，证实了PDA的光降解。

2.3. Gelatin-PDA水凝胶的制备

通过混合Gelatin-PDA、过硫酸铵（APS）和N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）在杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）中的溶液来制备水凝胶前体溶液，并在37°C下聚合20分钟形成水凝胶。

2.4. Gelatin-PDA水凝胶的光降解

使用365 nm（功率：1.41 mW/cm²）的UV灯和385 nm（功率：18.6 mW/cm²）的数字光处理（DLP）设备进行光照。在365 nm光照射22小时后，15%（w/v）的Gelatin-PDA水凝胶从淡黄色转变为深棕色流动状态，表明发生光降解。荧光显微镜观察凝胶横截面显示，照射区域出现了蓝色荧光层，厚度约200 μm，且荧光强度随照射时间增加而增强，这证实了凝胶表面区域发生了光降解，降解产物具有荧光特性。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析显示，在光照射后，与PDA相关的硝基基团吸收带强度降低，而明胶主链的结构得以保持。

2.5. 细胞培养

人骨髓间充质干细胞（hMSCs）被接种在经光照射和未经照射的Gelatin-PDA水凝胶表面，培养24小时。使用罗丹明鬼笔环肽和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）对细胞骨架和细胞核进行染色，并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行观察。

2.6. 统计分析

数据以平均值±标准差表示。两组样本间的比较采用学生t检验或双因素方差分析，以p< 0.05为具有统计学意义。

1. 3.
   结果与讨论
   3.1. Gelatin-PDA大分子的光降解行为表征
   成功合成了Gelatin-PDA。UV-vis光谱变化证实了其在光照下发生降解，最大吸收波长从349 nm降至316 nm。

3.2. Gelatin-PDA水凝胶的光降解行为表征

光照射导致水凝胶物理状态和颜色发生改变，表明降解发生。通过荧光显微镜观察横截面，证实降解主要发生在凝胶表层，深度约200 μm。红外光谱分析进一步支持光降解发生在PDA部分，而明胶主链结构保持完整。

3.3. Gelatin-PDA水凝胶上细胞粘附的调控

细胞实验表明，当hMSCs接种在光照射的Gelatin-PDA水凝胶上时，细胞的粘附数量减少，而细胞骨架（肌动蛋白）的铺展面积增加。具体而言，与未照射区域相比，在20%（w/v）水凝胶上，光照射区域的细胞粘附数量减少了约25.1%，但单个细胞的肌动蛋白面积增加了约52.1%。在15%（w/v）水凝胶上也观察到类似趋势。这表明光降解改变了水凝胶的表面特性（如刚度），从而影响了细胞的粘附和铺展行为。进一步使用DLP设备进行微图案化照射（正方形图案，照射时间2-10分钟）后，细胞粘附数量随照射时间延长呈下降趋势，说明可以通过精细调节光照参数来调控细胞的生物学行为。

1. 4.
   结论
   本研究成功合成了一种光降解的明胶丙烯酸酯（Gelatin-PDA）水凝胶。通过改变Gelatin-PDA浓度和紫外光照射条件（如照射时间、面积），可以对水凝胶表面进行调控，从而影响人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的粘附与铺展行为。将这种Gelatin-PDA水凝胶与先进的三维打印技术（如立体光刻）结合，有望实现对细胞行为的动态、精确调控，为生物制造和再生医学（如动态细胞迁移、血管组织建模）创建可调的生物微环境开辟了新途径。未来工作旨在将此技术应用于通过特定波长的光刻技术制造三维水凝胶细胞支架，并利用另一波长的光诱导光降解，实现精确的结构调控。