《Analytical Chemistry》：High-Throughput Testing for Unknown Mutagens and Cytotoxica via Duplex Planar Ames–Cytotoxicity Bioassay Including Metabolic S9 Activation
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本文介绍了一种创新的高通量双平面Ames-细胞毒性生物检测法，成功克服了复杂样本（如茶、化妆品、护肤品、香水）非靶向诱变剂分析中面临的基质效应、细胞毒性、扩散干扰和灵敏度不足等长期挑战。该检测法通过整合平面色谱并行分离、物质区带固定、人/大鼠肝脏S9酶系统代谢（脱）活化以及四唑盐（MTT）底物双终点读取等关键技术，实现了对痕量未知诱变剂和细胞毒性物质的高灵敏、高选择性检测。相比现有技术，该方法将检测时间缩短5倍，手动工作量减少330倍，并大幅降低了耗材成本。此方法为危害最小化、监管安全与风险评估、工业质量控制和药物开发提供了强有力的新工具。
摘要：挑战与创新
目前，对复杂样品中诱变剂进行非靶向效应导向分析（EDA）的方法面临着多重挑战，包括基质效应、伴随的细胞毒性、扩散效应、灵敏度不足以及选择性缺乏。传统方法可能遗漏痕量、高效力且未知的诱变剂。为突破这些局限，研究团队开发了一种双平面Ames诱变性-细胞毒性生物检测法。该方法能够灵敏且选择性地检测单个诱变剂和细胞毒性化合物，并可选择是否进行代谢活化。其核心创新在于：可对样本或其粗提物进行高通量测试，并通过平面色谱进行并行分离；采用物质区带固定技术以防止长时间孵育过程中的扩散；整合了人源与大鼠肝脏S9酶系统用于代谢（脱）活化；并使用一种四唑盐（MTT）底物提供双终点读数。与现有技术相比，该方法将获得结果的时间缩短了5倍，手动工作量减少了330倍，且几乎无需塑料耗材的成本降低了651倍。研究证明，该检测法能够选择性地、灵敏地、定量地揭示高度复杂样品（如茶、化妆品、护肤霜和香水）中先前未知的诱变剂和细胞毒性物质。例如，每日暴露于11.5克护肤品的量，其诱变性剂量已超过半数最大效应剂量（ED50）至少4个数量级。通过使用开源且可持续的2LabsToGo-Eco平台，这种新的双平面生物检测法可在全球范围内应用，成为危害最小化、支持监管安全与风险评估、工业质量控制及药物开发的宝贵工具。
引言：现有方法的局限与机遇
复杂样品中诱变剂的非靶向分析存在显著局限性。基于浓度的方法，如高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS/MS），会遗漏未知的及痕量的高效力诱变剂。而基于效应的方法，如体外微孔板诱变性生物检测（仅提供总和值），可能因不溶性、凝固、沉淀、胶束形成、对塑料表面的吸附、伴随的细胞毒性、假阳性、假阴性等问题而阻碍或掩盖诱变剂的检测。在众多诱变性生物检测中，Ames检测因其仅需标准实验室设备的成本效益高的工作流程，已成为过去五十年中最古老且应用最广泛的检测方法。尽管耗时3天，但它被认为比其他诱变性检测（如易受pH和渗透压等参数变化影响而导致假阳性结果的哺乳动物细胞测试）更简单、更稳健，并且与至少一项后续体外哺乳动物细胞测试中的一个阳性结果相比，其诱变性预测性约为70-90%。对于Ames检测，可以使用不同的鼠伤寒沙门氏菌菌株。然而，据报道，仅TA98和TA100两种菌株就足以检测93%（2019年）至94%（2023年）的已知诱变剂。虽然已开发出多种改进的体外检测形式，包括Ames微孔板形式（MPF）检测和使用发光报告菌株的微孔板Ames检测，但当用于筛选复杂样品（如食品接触材料）时，基质干扰会损害诱变化合物的检测。复杂样品的体外微孔板检测分析鲜有报道，因为其总和值容易出错。茶、化妆品、护肤霜和香水等复杂基质严重损害了诱变剂分析，使得获得准确结果变得困难。
将诱变性测试与先前的色谱分离相结合，可能是处理复杂样品的改变游戏规则的方法。早在1982年，就有报道在薄层色谱板上进行诱变性测试的琼脂覆盖生物自显影及随后的细胞计数。然而，其缺点包括为防止过度扩散而需缩短孵育时间、菌落归属特定区带存疑，以及因手动涂抹琼脂和琼脂层厚度不均导致的重复性差。近期，Ames MPF体外检测形式被转移至高性能薄层色谱（HPTLC）板上的平面生物检测形式。但结果并不理想，原因在于孵育时间短（因区带扩散限制在5小时内）以及通过非选择性底物进行检测。这两种体外和表面检测形式都使用溴甲酚紫作为pH指示剂底物，通过检测代谢活动引起的酸化（颜色从紫色变为黄色）作为细菌生长的间接指标。然而，溴甲酚紫对诱变剂的选择性低，因为它也对酸性化合物（如植物酸、有机酸、糖酸和酸性代谢产物）有反应。
为了提高检测灵敏度、选择性以及区带分辨率，本研究旨在设计一种新的、更强大的平面Ames生物检测法。该检测法应能对日常使用的高度复杂样品（如茶、化妆品和护肤霜、香水）进行可靠的诱变性筛查，并提供定量结果（如半数最大效应诱变剂量，ED50）。研究还计划比较主要通过大鼠肝脏S9酶系统进行的代谢与新的人源肝脏S9酶系统的差异。同时，探究新诱变性与近期平面SOS-Umu-C生物检测筛查的基因毒性结果之间是否存在关联。该方法将被转移到经济实惠的开源2LabsToGo-Eco平台上，以展示效应导向分析领域所取得的全部潜力和进展。
实验部分
化学品与材料
研究使用了多种化学品和标准品，包括溶剂、诱变剂阳性对照（如4-硝基喹啉-N-氧化物4NQO、2-氨基蒽2AA）、参考化合物（如脂肪酸、单酰基/二酰基/三酰基甘油MAG/DAG/TAG候选物、矿物油饱和/芳香烃MOSH/MOAH候选物）、鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100菌株的冷冻细胞颗粒、大鼠肝脏S9系统、以及细胞系来源的人源酶S9组分。样品包括5种茶剂、22种化妆品和护肤霜、8种香水，均购自本地超市或药店。
培养基、底物、HiCultS9辅因子、Degalan及阳性对照溶液的制备
按照标准配方制备了生长培养基、缺陷培养基、MTT底物溶液、HiCultS9辅因子溶液（NADP、G-6-P、MgCl2）、用于区带固定的0.5% Degalan丙酮/乙醇溶液，以及各种阳性对照和参考物质的储备液。
TA98和TA100过夜培养物的冷冻储备制备
从冷冻细胞颗粒培养TA100和TA98菌株的过夜培养物，制备含10%甘油的冷冻储备，并储存于-80°C。用于生物检测的过夜培养物由冷冻储备接种至含氨苄青霉素的生长培养基中，于37°C摇育14-16小时制备。
阳性对照区带模式测试
将递增量的阳性对照溶液以区带形式点样于HPTLC板上，干燥后备用，用于后续生物检测的验证。
三种不同样品类型的制备与HPTLC分离
液体样品（香水）直接使用，固体样品（茶、化妆品/护肤霜）需经提取。
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茶剂用甲醇提取，超声、离心、过滤后，取上清点样，用二氯甲烷-甲醇-氨水展开。
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化妆品/护肤霜用水-甲醇-乙酸乙酯混合溶剂提取，处理后点样，用戊烷-乙醚展开。
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香水直接点样，用环己烷-乙酸乙酯展开。
展开后的板干燥，并在白光和荧光下检测。
双平面Ames-细胞毒性生物检测-Vis
在色谱图溶剂前沿上方点加阳性对照（4NQO、DMSO或N4ACT）并干燥。为固定区带，将Degalan溶液压电喷雾到色谱图上并干燥。将调整至OD6000.4的过夜培养物离心，用缺陷培养基重悬细胞，然后压电喷雾到HPTLC色谱图上。接种后的板置于加湿盒中，37°C孵育5小时。随后将MTT底物溶液喷雾到湿润的板上，再孵育24小时。干燥后，在白光下检测。诱变剂显示为紫色区带，背景为淡紫色。每个平面生物检测至少进行两次以确保生物自显影图的可重复性。
使用S9肝脏酶系统的表面代谢
流程基本同上，但有以下例外：阳性对照为2AA。细胞沉淀用含大鼠肝脏S9（现成溶液混合）或人源肝脏S9（HiCultS9，与辅因子混合）的缺陷培养基重悬。由于S9酶（高分子量蛋白质结构）可在HPTLC板上提供足够的区带固定，因此无需使用Degalan进行区带固定。
用于与基因毒性比较的平面SOS-Umu-C生物检测
流程已描述。使用TA1535菌株，调整OD600后喷雾到色谱图上，孵育3小时，干燥后喷雾resorufin-β-D-galactopyranoside底物溶液，再孵育30分钟，干燥后在可见光和荧光下检测。
定量剂量-反应分析
进行三次独立的剂量-反应研究。使用视频光密度法从生物自显影图中获得诱变区带的峰面积。平均诱变区带峰面积用于构建S形希尔函数并计算ED50。
使用HiCultS9代谢的2LabsToGo-Eco HPTLC-双平面Ames-细胞毒性生物检测-Vis
使用开源设备2LabsToGo-Eco进行分析。简要流程：将化妆品/护肤霜提取物过滤后，用设备点样于HPTLC板上，干燥。用填充好的注射器泵系统进行水平展开。干燥后，在可见光下检测色谱图。将含有HiCultS9的TA98菌悬液雾化到色谱图上，孵育5小时。然后雾化MTT底物溶液，再孵育24小时，干燥后检测生物自显影图。
结果与讨论
新型双平面Ames-细胞毒性生物检测-Vis（含S9代谢）概述
首个平面Ames生物检测尝试在检测灵敏度和选择性（通过非选择性溴甲酚紫pH指示剂底物）以及区带分辨率方面有待改进。研究测试了多种底物以获得更好的选择性和灵敏度，最终发现四唑盐MTT效果最佳。新开发的HPTLC-双平面Ames-细胞毒性生物检测-Vis方法（可选择使用区带固定或人/大鼠肝脏S9酶系统代谢）工作流程得以确立。使用即喷型冷冻储备可使操作简化。具体而言，在平面色谱并行分离多达22个不同样品后，将缺陷培养基中的营养缺陷型沙门氏菌喷雾到分离后的样品上，孵育5小时。在诱变区带上，沙门氏菌发生回复突变变为原养型，在此阶段代谢活跃。在板背景上，缺陷培养基中的营养缺陷型沙门氏菌死亡或代谢严重受抑制。这5小时的孵育是为后续在同一表面上应用MTT底物进行24小时孵育的先决条件。优化MTT底物量后，营养缺陷型沙门氏菌在首次5小时孵育后受抑制的代谢提供了明亮的板背景，使得第二次24小时孵育中少数自发回复突变可见为淡紫色板背景。相反，分离样品中的诱变剂导致许多回复突变的沙门氏菌变为原养型且代谢活跃，从而将MTT底物强烈还原为紫色甲臜。因此，紫色区带表明存在诱变剂。值得注意的是，甲臜着色是pH依赖性的。此外，沙门氏菌群体中较低的自发回复突变率导致整个板上出现微弱的淡紫色背景信号。发白的黄色区带，其中这些最小的自发回复突变不再可检测，反映了由于细胞代谢严重抑制伴随细胞死亡而产生的强烈细胞毒性效应。因此，这种“发白”反应被操作性地解释为除紫色诱变性读数之外的细胞毒性终点。这突出了在单个生物自显影图上同时可视化和区分同一分离样品中单个诱变性和细胞毒性化合物的关键优势。这种通过细胞活力实现的选择性双读数被认为是一种新颖的方法，并带来了巨大益处，提高了Ames检测的效率和可靠性。
诱变性阳性对照测试
初始的双平面Ames-细胞毒性生物检测未使用区带固定，且第二次表面孵育时间比最终方案短25%（18小时而非24小时）。测试了三种诱变性阳性对照和另外三种需要代谢活化的阳性对照的不同剂量。无细菌对照板和生物检测前可见光图像证实，紫色形成（MTT还原为紫色甲臜）是由沙门氏菌的回复突变特异性引起的。4NQO在0.3 μg/区带时在TA98中产生诱变反应（紫色内核区带），而TA100对测试的4NQO剂量未显示可检测的诱变性。这证明了菌株依赖的诱变性。对于N4ACT，在1 μg/区带时观察到对TA98和TA100的诱变性。DMSO在较高测试剂量下（TA98为200 μg/区带；TA100为1000 μg/区带）显示出诱变性。需要代谢活化时，AO在大鼠肝脏S9酶系统下于0.001 μg/区带在两菌株中诱导诱变反应，在人源肝脏S9酶系统下于0.01 μg/区带在两菌株中诱导强诱变反应，但在更高剂量时被其自身的黄橙色掩盖。2AA仅显示轻微的菌株特异性差异，在大鼠肝脏酶系统下，0.001 μg/区带即产生诱变性，通过TA100比TA98稍易检测。在大鼠肝脏酶系统代谢活化下，沙门氏菌阴性对照板上的类似区带（标记为-）是由S9还原酶被2AA触发引起的假阳性细胞毒性/诱变反应，剂量高于1 μg/区带时出现。因此，推荐使用沙门氏菌阴性对照板来验证代谢活化。用人源肝脏S9酶系统测试2AA，由于组成差异，未检测到此类效应。2AA在0.01 μg/区带通过人源肝脏S9酶系统诱导更强的诱变效应。2AF在0.001 μg/区带通过大鼠肝脏酶系统在两菌株中显示诱变活性，但在高于1 μg/区带时被其黄橙色掩盖。用人源肝脏S9酶系统测试2AF，在0.01 μg/区带在两菌株中检测到更强的诱变反应。总体而言，代谢活化下的诱变性检测下限至1 ng/区带，对于后续样品筛查具有足够的灵敏度。
应用于复杂样品
微孔板基Ames检测无法应对茶剂等高复杂性样品，它们仅评估样品的总体活性作为总和值，这使得检测终点极易受基质效应影响。相比之下，平面生物检测法能够进行色谱分离，并独立于基质对单个诱变剂进行检测、区分和归属。这种分离与选择性灵敏检测的结合可用于应对样品的复杂性。因此，将初始的双平面Ames-细胞毒性生物检测应用于五种不同茶叶的甲醇提取物。MTT底物和更长的第二次孵育（18小时而非5小时）比首次尝试使用溴甲酚紫pH指示剂底物和5小时短孵育的平面Ames生物检测效果更好。在黑茶和草药茶提取物中检测到明显的紫色诱变区带。这些区带在相应的沙门氏菌阴性对照板上不存在，验证了诱变反应。一些诱变剂在大鼠肝脏S9酶系统代谢后保持稳定，表明是代谢抗性的诱变剂。其他诱变剂在S9代谢后消失，主要涉及细胞色素P450介导的反应，产生不再可检测的非诱变性代谢物，表明了解毒作用。在两个有/无大鼠肝脏S9酶系统代谢的沙门氏菌阴性对照板上，特别是绿茶提取物不仅引起酶促S9诱导的，还引起化学的MTT还原，这归因于儿茶素作为氧化还原活性化合物的作用。这凸显了需要使用沙门氏菌阴性对照板来合理解释多酚丰富样品中检测到的诱变剂。为支持MTT基的发现，还使用HPTLC-SOS-Umu-C-FLD生物检测评估了相同茶叶提取物的基因毒性。观察到类似的区带特异性基因毒性效应，S9活化后荧光信号显著更强。正如这些可靠的结果和为高度复杂样品获得的重要信息所证明的，平面生物检测形式相对于经典的体外检测具有决定性优势。它解析了高度复杂基质中多个不同的诱变性和细胞毒性化合物区带，而这些在微孔板检测形式中通常会被掩盖。
使用区带固定（以化妆品和护肤霜提取物为例）
长时间高湿度孵育过程中的区带扩散会损害区带锐度，从而影响分辨率。因此，研究了使用Degalan进行区带固定以改善区带锐度，用于分析22种化妆品和护肤霜中的诱变剂。在几乎所有提取物中都检测到诱变剂。使用0.5% Degalan浓度减少了区带扩散，产生了更锐利的区带，并能够清晰地可视化紫色诱变区带。未观察到由于表面过量Degalan导致的潜在信号强度降低。Degalan形成聚合物膜，可有效固定物质区带，同时仍允许物质在含水介质中充分扩散，确保与沙门氏菌细胞接触。因此，聚合物膜在不损害生物检测反应的情况下减少了扩散，这在有/无区带固定的样品区带中可比的信号强度得以证明。后续所有生物自显影图（标记为HPTLCfix）均使用0.5% Degalan进行区带固定，但使用S9代谢的板除外，因为大分子S9酶蛋白提供了足够的区带固定，无需额外的聚合物膜固定。
延长第二次孵育时间（以化妆品和护肤霜提取物为例）
为增强检测灵敏度，将第二次18小时孵育时间延长至24和48小时，并在TA98和TA100两菌株上进行了测试。一方面，18小时孵育已检测到主要诱变剂；然而，它未能检测到弱诱变剂，因为18小时的紫色甲臜着色相对较弱。值得注意的是，对于TA100，18小时孵育的信号相对24小时孵育更弱。另一方面，将孵育延长至48小时导致几种化妆品和护肤霜提取物出现更高的区带扩散。总体而言，24小时孵育是信号强度和区带锐度之间的良好折中。它确保了诱变剂的全面检测，同时保持了区带分辨率，因此被选用于所有后续生物检测。
混合区带外观的解读
生物自显影图中存在明显的混合区带外观。这种现象在亲脂性样品中最为明显，由相同结构组分的候选物共洗脱引起，例如不同的MAGs、DAGs和TAGs。以归属于DAGs的区带b为例进行讨论。一方面，强烈的紫色诱变中心区带被锐利的发白黄色晕圈包围。紫色中心区带表示诱变剂，而发白的黄色晕圈（无细胞代谢）表明共洗脱的细胞毒性化合物。另一方面，发白的黄色细胞毒性化合物区带中心被紫色边缘包围，这解释为边缘有共洗脱的诱变剂。此外，区带中心的另一个诱变剂与周围发白的黄色细胞毒性化合物区带共洗脱，并被作为紫色边缘显现的诱变剂包围。对样品5使用TA98和TA100进行的剂量-反应研究表明，区带b的外观取决于所施加的量，随着量的增加形成混合区带外观。
混合区带外观中的单个候选物可以通过测试最佳流动相或固定相进行剂量依赖性迁移来澄清，或者通过高度简化的联用技术，即在线正交二次分离（例如，反相C18相）可以澄清哪些候选物在同一区带中共洗脱。直接从生物自显影图并完全自动化，活性化合物区带可以通过洗脱进一步表征，进行反相高效液相色谱、二极管阵列检测和高分辨质谱分析。该化合物区带与富含盐的生物检测介质一起从硅胶层洗脱，在通过阀切换脱盐过程中被捕集在预柱环中，然后导向正交反相高效液相色谱-二极管阵列检测-高分辨质谱。通过正相HPTLC-紫外/可见/荧光-效应导向分析-反相高效液相色谱-二极管阵列检测-高分辨质谱的多维联用，可以获得关于未知活性化合物区带的多达12种不同的物理化学、色谱、效应导向和光谱特征。科学家获得的信息越多，化合物鉴定的速度就越快。
通过大鼠与人源肝脏S9酶系统代谢的比较
比较通过大鼠肝脏S9酶系统在TA98和TA100菌株之间的代谢，显示诱变区带模式几乎没有差异。对于两种菌株，检测到相同的诱变区带，表明相同的物质被活化为诱变剂。观察到的信号的诱变性质通过相应的含S9酶系统的沙门氏菌阴性对照板得到验证，该板除了一个微弱的褐色假阳性区带外，没有显示紫色化合物区带。这个微弱的褐色化合物区带也出现在无S9和无沙门氏菌的板上，而未出现在生物检测前可见光色谱图上，因此是由化学MTT还原引起的。因此，相应的诱变区带因其微弱的褐色反应而被略微高估了其诱变性。几个诱变区带在有/无代谢的情况下保持其稳定的紫色着色，表明诱变性未改变。也观察到对发白的黄色细胞毒性物质的改变毒性作用，它们在代谢后转变为亚细胞毒性但诱变的化合物量，表现为外围紫色边缘。在亚细胞毒性S9生物自显影图上，单个活性区带更容易检测。细胞毒性和诱变性哪个是更坏的选择问题仍然存在。其他弱诱变区带在代谢活化后诱变性增加，即前诱变化合物需要酶促转化为其诱变形式，表明毒性增强。这种通过细胞色素P450酶进行的S9依赖性代谢活化对于可氧化的亲脂性化合物是已知的，包括不饱和脂肪酸衍生物、甘油酯或矿物油残留物，它们能够通过亲电中间体在细菌系统中诱导点突变。
研究了物种依赖性代谢，并
