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本研究综述了Nesprin-2/BicD2复合物的结构与功能。该工作利用AlphaFold预测了Nesprin-2与动力蛋白接头BicD2之间最小复合物的结构模型，并通过实验验证。该复合物的核心由Nesprin-2的血影蛋白重复（SR）与BicD2的C端货物结合域（CTD）形成的α-螺旋束构成，与Rab6/BicD2和Nup358/BicD2复合物结构不同。研究发现，一个或两个Nesprin-2分子结合BicD2二聚体均可激活动力蛋白（dynein）/动力蛋白激活蛋白（dynactin）/BicD2复合物进行持续的微管运动。BicD2/dynein结合位点与驱动蛋白-1（kinesin-1）结合位点（LEWD基序）空间上临近但不重叠，暗示两种马达可同时结合Nesprin-2。研究还发现，导致Emery-Dreifuss肌营养不良症（EDMD）的Nesprin-1/2突变位于马达募集域，可能通过改变与动力蛋白和驱动蛋白-1的互作影响核定位，这阐明了该通路在脑和肌肉发育中的关键作用，并为相关发育疾病的机制提供了见解。
引言
Nesprin-2及其旁系同源物Nesprin-1是连接核骨架与细胞骨架（LINC）复合物的亚基，对大脑和肌肉发育至关重要。在神经元迁移过程中，Nesprin-2通过与驱动蛋白-1和动力蛋白互作来定位细胞核，其中动力蛋白由接头蛋白Bicaudal D2（BicD2）募集，但这些相互作用的分子细节尚不清楚。此外，BicD2还参与其他对脑发育至关重要的运输途径，包括与核孔蛋白Nup358和Rab6GTP的互作。人类BicD2的疾病突变会导致严重的脑和肌肉发育缺陷，而Nesprin-1/2的突变则与Emery–Dreifuss肌营养不良症（EDMD）相关，患者常出现细胞核异常聚集。因此，阐明Nesprin-2/BicD2复合物的结构基础对于理解相关核定位通路的机制及其在发育疾病中的作用具有重要意义。
材料与方法
结构预测
使用ColabFold v1.5.5（其实现了AlphaFold）进行结构预测。预测了BicD2-CTD（人BicD2氨基酸715–804）与小鼠Nesprin-2（氨基酸6123–6421）以1:2和2:2化学计量比形成的异源二聚体结构模型。还预测了包含更大Nesprin-2片段（氨基酸5692–6342）和BicD2-CC3（氨基酸667–804）的复合物模型。使用UCSF ChimeraX制作结构图，并通过PISA服务器识别接触残基。
GST下拉实验
构建了N端GST标签的小鼠Nesprin-2片段（氨基酸6123–6421）和N端his6标签的人BicD2-CTD（氨基酸715–804）的表达载体。通过定点诱变获得突变体。蛋白在大肠杆菌中表达并纯化。将纯化的BicD2-CTD与固定在谷胱甘肽柱上的GST-Nesprin-2片段孵育，洗涤后洗脱，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析结合情况，并使用ImageJ对条带强度进行定量。
圆二色光谱
对GST标签的Nesprin-2片段（野生型和突变体）进行圆二色光谱分析。蛋白在10°C下使用Jasco J-1100光谱仪测量，波长范围250-190 nm。使用BeStSel程序从CD光谱估算二级结构。
单分子结合与运动性实验
从牛脑组织纯化胞质动力蛋白、动力蛋白激活蛋白和微管蛋白。表达并纯化全长人BicD2、小鼠驱动蛋白-1以及带有不同标签的Nesprin-2片段。对于单分子结合实验，用不同荧光标记的链霉亲和素标记蛋白，在玻片表面通过全内反射荧光显微镜观察共定位。对于单分子运动性实验，按特定摩尔比组装动力蛋白/动力蛋白激活蛋白/BicD2/Nesprin-2（DDBN）复合物，用量子点标记BicD2或Nesprin-2。将复合物注入表面固定了微管的流道，记录其运动轨迹，分析结合率、运动比例、速度和行程长度。
结果
通过AlphaFold获得高置信度的最小Nesprin-2/BicD2复合物结构模型
通过尺寸排阻色谱耦合多角度光散射确定了最小Nesprin-2/BicD2复合物的化学计量比为2:2。使用AlphaFold预测了该最小复合物的结构模型。在模型中，Nesprin-2的SR52和SR53与BicD2-CTD形成一个α-螺旋束。预测对齐误差图显示界面区域误差主要低于5–10 ?，表明预测置信度高。局部距离差异测试分數在80-98之间，也表明模型可靠。包含Nesprin-2内在无序结构域（含有驱动蛋白-1募集位点LEWD基序）的区域不参与与BicD2的相互作用。此外，还预测了1:2化学计量比的复合物结构，其与2:2复合物结构高度相似。研究还证实了旁系同源物Nesprin-1的相应结构域也能与BicD2-CTD直接相互作用，其预测的结构模型与Nesprin-2复合物相似。
Nesprin-2/BicD2-CTD复合物结构模型的验证
通过构建一系列Nesprin-2缺失体并进行GST下拉实验验证结构模型。缺失整个内在无序结构域（含LEWD基序）的Nesprin-2最小片段（氨基酸6123–6340）仍能强效结合BicD2-CTD，证实该域对结合是非必需的。而缺失SR52和SR53的构建体则无法下拉BicD2-CTD。进一步，根据结构模型对Nesprin-2和BicD2的接触残基进行丙氨酸突变。下拉实验鉴定出BicD2的五个突变体和Nesprin-2的五个突变体能显著降低结合。其中，设计了一个破坏Nesprin-2与BicD2之间关键疏水接触的三重突变体（V6246A/L6253A/F6261A），该突变体几乎完全废除了相互作用。圆二色光谱分析表明，这些降低结合的Nesprin-2突变体的二级结构与野生型相似，说明突变并未导致蛋白错误折叠或大的结构变化，从而验证了这些残基是真正的接触残基。
三种对脑发育重要的BicD2/货物复合物结构模型比较
将新建立的Nesprin-2/BicD2复合物模型与此前已验证的Nup358/BicD2和Rab6GTP/BicD2复合物模型进行比较。三者结构截然不同：Nesprin-2通过其SR与BicD2形成螺旋束；Nup358通过一个货物识别α螺旋结合在BicD2-CTD中部，该螺旋在游离状态是无序的；而Rab6GTP则结合在BicD2-CTD的极端C端区域。Nesprin-2和Nup358的BicD2结合位点之后都有一段内在无序连接区和一个LEWD基序（驱动蛋白-1结合位点），但Nesprin-2的连接区更长（约65个残基对约30个残基）。Rab6则缺乏已知的驱动蛋白-1募集位点。这些结构差异可能微调所募集动力蛋白和驱动蛋白-1的整体运动性。
Nesprin-2片段与全长BicD2及全长驱动蛋白-1结合
单分子结合实验显示，包含LEWD基序的较大Nesprin-2片段（氨基酸6123–6421）与全长驱动蛋白-1存在强相互作用。而不含LEWD基序的片段与驱动蛋白-1的结合仅为背景水平。同时，不含LEWD基序的最小Nesprin-2片段（氨基酸6123–6352）与全长BicD2存在强相互作用，而破坏BicD2结合的三重突变体则显著削弱了这种结合。
一个Nesprin-2分子即可激活动力蛋白/动力蛋白激活蛋白/BicD2复合物进行持续运动
单分子运动性实验表明，Nesprin-2片段能够解除BicD2的自抑制，从而激活动力蛋白/动力蛋白激活蛋白/BicD2（DDBN）复合物进行持续的微管运动。与自抑制的DDB复合物相比，DDBN复合物与微管的结合率更高，发生持续运动的比例更高，并表现出可测量的速度和行程长度，但其激活水平低于组成型活性片段BicD2CC1形成的DDBCC1复合物。该结果证实无需其他组分即可激活此运输通路。通过使用红色和绿色量子点分别标记Nesprin-2片段，发现约22%的DDBN复合物结合了两个Nesprin-2分子，78%的复合物只结合了一个Nesprin-2分子。重要的是，结合一个或两个Nesprin-2分子的DDBN复合物，其运动速度和行程长度没有统计学差异，表明一个Nesprin-2分子足以激活BicD2介导的动力蛋白运动。
讨论
本研究提出了一个经过实验验证的最小Nesprin-2/BicD2复合物结构模型，其核心是Nesprin-2的SR与BicD2-CTD形成的α-螺旋束。一个或两个Nesprin-2片段可预测性地结合到BicD2二聚体的对称结合位点上。包含驱动蛋白-1募集位点LEWD基序的内在无序结构域对BicD2结合是非必需的，这表明驱动蛋白-1和BicD2/动力蛋白有可能同时与Nesprin-2相互作用。最小Nesprin-2片段能与全长BicD2结合，并强效激活BicD2/动力蛋白/动力蛋白激活蛋白复合物进行持续运动，且结合一个或两个Nesprin-2分子所产生的运动特性相似。Nesprin-2/BicD2相互作用在结构上不同于其他BicD2/货物复合物，这种差异可能微调相关运输通路的整体运动性。
Nesprin-2的细胞质结构域可能受F-肌动蛋白结合等因素调节其寡聚状态，而单一或双重Nesprin-2分子均可激活BicD2的特性，可能使得动力蛋白的运动性独立于细胞中Nesprin-2的寡聚状态。有研究表明SR48能增强BicD2与Nesprin-2的亲和力，但包含SR52-SR56的马达募集结构域（不含SR48）的迷你Nesprin-2已能在体内恢复正常的神经元迁移，且本研究中仅含SR52和SR53的最小片段在体外能强效激活动力蛋白复合物，因此SR48对马达募集和通路激活并非必需。
导致脑和肌肉发育疾病的BicD2突变对其与不同货物（Nesprin-2、Nup358、Rab6）的亲和力有差异化影响，从而调控相关细胞运输通路。这与此前三种BicD2/货物复合物结构模型揭示的结合位点重叠但不同的结论一致。此外，数个人类EDMD致病突变位于Nesprin-1/2的马达募集结构域内，可能通过改变与BicD2和驱动蛋白-1的相互作用，影响动力蛋白和驱动蛋白-1介导的肌核定位，从而导致患者出现异常聚集的细胞核。Nesprin-2和BicD2的多个磷酸化位点可能为此通路的时空调控提供了机制。
结论
本研究建立并验证了最小Nesprin-2/BicD2复合物的结构模型。复合物核心由Nesprin-2的血影蛋白重复与BicD2形成的螺旋束构成，该结构不同于其他已知的BicD2/货物复合物。结构上的差异可能调节相关运输通路的整体运动性。BicD2/动力蛋白结合位点与驱动蛋白-1结合位点在空间上临近但不重叠。研究发现，募集一个或两个Nesprin-2片段至BicD2/动力蛋白/动力蛋白激活蛋白复合物，均可强效激活其进行持续运动，且速度和行程长度相似，表明此运输通路无需其他额外组分。研究还设计了一个能破坏BicD2与Nesprin-2相互作用的三重突变体，这将为研究该核定位通路在脑发育中的作用提供有价值的工具。数个EDMD致病突变位于Nesprin-1/2的马达募集结构域，可能改变其与BicD2和驱动蛋白-1的相互作用，这与EDMD患者细胞核异常聚集的现象相符。本研究结果将指导未来深入探索Nesprin-1/2在脑和肌肉发育中的关键作用，并揭示由Nesprin-1/2和BicD2突变（如EDMD和脊髓性肌萎缩症）引起的严重发育疾病的潜在机制。
