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本文探讨了环境浓度氮氧化物（NO2）慢性吸入对小鼠系统性免疫与造血功能的影响。研究发现，NO2暴露不仅引发外周血贫血，更特异性扰乱骨髓（BM）的造血稳态，导致红系分化在正成红血球（ortho-EB）阶段、粒系（中性粒细胞，NE）分化在中幼粒细胞（MM）阶段发生阻滞。这些发现为理解空气污染物引发的血液系统疾病风险提供了新的机制见解。
引言：无处不在的健康威胁
二氧化氮（NO2）是一种广泛存在的空气污染物，主要来源于汽车尾气、工业排放及室内燃料燃烧。全球约42%的人口暴露于超过世界卫生组织（WHO）指导值的NO2浓度。流行病学研究表明，NO2暴露是呼吸系统、神经系统疾病的风险因子，并且与贫血发病率显著升高相关。然而，NO2暴露如何影响在疾病发病机制中起关键作用的免疫和造血功能，目前尚不清楚。作为一种高活性氧化剂气体，吸入的NO2在气道表面液体中反应生成活性氮物种，如亚硝酸盐（NO2–）和过氧亚硝酸盐（ONOO–），诱发氧化和硝化应激，破坏细胞氧化还原稳态，并可能激活核因子κB（NF-κB）等促炎通路。骨髓（BM）是稳态下造血的主要场所，持续生成和更新血细胞，对来自外周组织的炎症和氧化信号高度敏感。本研究旨在通过流式细胞术等单细胞方法，系统性探究环境相关浓度的NO2慢性暴露对小鼠多组织造血功能与免疫反应的影响。
材料与方法
本研究使用6周龄雌性BALB/c小鼠，将其随机分为对照组和NO2暴露组。为模拟家庭使用燃气器具时常见的每日峰值暴露场景，采用间歇性暴露设计，使小鼠暴露于2.5 ppm NO2（每天5小时，持续28天），这对应于约0.52 ppm的24小时时间加权平均浓度，与环境相关浓度可比。暴露结束后，收集外周血进行全血细胞计数（CBC）分析。处死小鼠后，分别制备肺、脾脏和骨髓（BM，取自股骨和胫骨）的单细胞悬液。对于免疫细胞分析，使用红细胞裂解液处理样本；对于红系分析，BM样本不经裂解直接用于染色。使用多种荧光标记抗体，通过流式细胞术对成熟免疫细胞、造血祖细胞、红系前体细胞和中性粒细胞（NE）前体细胞进行鉴定和绝对计数。数据以均值±标准差表示，采用独立样本t检验进行统计学分析，p< 0.05认为有统计学意义。
结果
慢性NO2暴露降低外周红细胞计数和血红蛋白水平
经过28天暴露后，NO2暴露组小鼠的外周血红细胞（RBC）计数和血红蛋白（HGB）浓度均较对照组显著降低约10%，表明出现了实验性贫血。而血细胞比容（HCT）、红细胞指数以及白细胞（WBC）总数、淋巴细胞（LY）、中性粒细胞（NE）、单核细胞（MONO）等各亚类计数均无显著变化。体重在整个暴露期间保持稳定，排除了营养不良的干扰。这些结果提示慢性NO2暴露可能选择性损害红系生成。
慢性NO2暴露引发骨髓中性粒细胞减少
为了全面评估NO2的全身免疫影响，研究分析了暴露部位（肺）、中央免疫调节区（BM）和外周免疫器官（脾脏）的成熟免疫细胞群。结果显示，在肺和脾脏中，包括B细胞、T细胞、NE、巨噬细胞（Mφ）、树突状细胞（DC）亚群等在内的各类免疫细胞绝对计数在两组间均无显著差异，表明在此暴露条件下未诱发肺部炎症或脾脏免疫稳态改变。然而，在BM中，NO2暴露组成熟NE的数量较对照组显著减少了31%，而其他免疫细胞（B细胞、T细胞、DC、单核细胞等）则无变化。这一发现表明，与外周肺和脾脏相比，BM对NO2暴露更为敏感，且BM中NE的减少并非由于其向外周迁移所致。
慢性NO2暴露破坏骨髓中的红细胞生成和粒细胞生成
为了探究外周红细胞减少和BM中性粒细胞减少是否反映了更广泛的造血调控紊乱，研究进一步分析了BM、脾脏和肺的造血区室。结果显示，NO2暴露的影响主要局限于BM，对脾脏和肺的造血祖细胞数量无显著影响，表明未触发代偿性髓外造血（EMH）。
在BM的造血祖细胞层面，NO2暴露显著增加了谱系限制性祖细胞（LK细胞）、共同髓系祖细胞（CMP）和共同淋巴样祖细胞（CLP）的数量，分别增加了15%、26%和54%，而巨核细胞-红细胞祖细胞（MEP）数量无变化。在红系前体细胞中，前红系集落形成单位（preCFU-E）和正成红血球（ortho-EB）的数量分别显著增加了23%和13%，而网织红细胞的数量则减少了15%。早期前体的累积伴随后期网织红细胞的减少，表明红细胞生成受到抑制，并在ortho-EB阶段发生分化阻滞。
在中性粒细胞生成过程中，流式分析显示，中幼粒细胞（MM）的数量较对照组显著减少了16%，而更早的前体（原粒细胞MB、早幼粒细胞PM、中幼粒细胞MC）和更晚的阶段（杆状核/分叶核细胞BC/SC）基本未受影响。这提示NO2暴露可能特异性靶向中性粒细胞分化过程中的MM阶段，造成发育缺陷。
讨论与结论
本研究首次提供了实验证据，支持流行病学观察到的NO2暴露与贫血风险之间的关联。研究发现，长期吸入环境相关浓度NO2可导致小鼠外周血贫血和BM中性粒细胞减少，其根本机制在于NO2特异性地扰乱了BM内的造血过程。
BM造血功能紊乱呈现出组织特异性，可能与不同造血部位的抗氧化能力差异有关。BM造血细胞高度依赖精确调控的Nrf2信号维持氧化还原稳态，且其微环境可能限制抗氧化反应，使其对NO2诱导的氧化损伤尤为敏感。
在红细胞生成方面，NO2暴露可能通过双重机制破坏红系稳态。一方面，NO2代谢物可能导致高铁血红蛋白形成，模拟全身性缺氧状态，激活缺氧诱导因子（HIF）-促红细胞生成素（EPO）轴，驱动早期红系前体（如preCFU-E）扩增。另一方面，NO2产生的活性氧（ROS）可能诱发系统性氧化应激，特异性损害红细胞生成的终末分化阶段。ROS可能通过诱导膜脂质过氧化和细胞骨架蛋白交联，显著抑制正成红血球（ortho-EB）的去核效率，导致其滞留，从而抵消了上游前体的扩增，最终导致网织红细胞产出减少和贫血。
在粒细胞生成方面，NO2暴露选择性减少了中幼粒细胞（MM）的数量。MM阶段（对应单细胞转录组定义的preNE）是代谢活跃的增殖期，需要强烈的核苷酸和蛋白质合成。NO2衍生的ROS可能通过氧化关键转录因子（如C/EBPδ）或NO2代谢物（亚硝酸盐）干扰维生素B12依赖的甲硫氨酸合成酶功能，从而破坏DNA合成，导致MM细胞增殖受阻。尽管MM阶段受损，成熟中性粒细胞（BC/SC）数量在BM和外周血中保持稳定，这可能得益于加速的骨髓释放或循环寿命延长等代偿机制，但也提示仅依靠外周血计数可能低估早期的粒细胞生成毒性。
综上所述，本研究揭示了NO2暴露通过诱导红系和粒系阶段特异性分化阻滞，从而破坏骨髓造血功能的新机制。这些发现强调了评估空气污染物多系统相互作用的重要性，并为理解NO2相关的血液系统疾病风险提供了新的病理生理学见解。未来的研究需要纳入多剂量和更长时间暴露，以明确剂量反应关系和时间进程，从而更好地进行定量风险评估。
