《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Study of Intact Glycosidic Aroma Precursors in Recovered Minority White Grape Varieties under Water Stress Conditions
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本研究聚焦于西班牙卡斯蒂利亚-拉曼恰产区两个本土珍稀白葡萄品种Pintada和Jarrosuelto，在两种水分胁迫（重度/生存、中度/亏缺）条件下，与当地主栽品种Airén进行了比较。研究旨在探讨这些珍稀品种在缺水条件下的糖苷化香气前体（完整形态）积累与组成，揭示其应对水分胁迫的品种依赖性响应，并鉴定潜在的品种标记物。研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC/QTOF）技术，对包括苯甲酸类、单萜醇、脂肪族醇、降异戊二烯类等在内的20种完整糖苷香气前体进行分析。结果表明，品种是影响香气前体组成的主要因素，其中Pintada在重度水分胁迫下表现出更强的糖苷化前体积累能力。此外，研究首次在Airén中鉴定出独特的C13-降异戊二烯类己糖-己糖衍生物，在Jarrosuelto中鉴定出独特的异丙醇戊糖基-己糖苷同分异构体，这些可作为潜在的品种特异性标记物。该研究为评估珍稀葡萄品种在缺水条件下的酿酒适宜性和品种鉴别提供了新的代谢组学视角。
水分胁迫对珍稀白葡萄品种完整糖苷香气前体的影响与品种标记物研究
在气候变化导致葡萄种植区面临高温和水资源减少的背景下，发掘能够适应特定种植区、耐受干旱条件的本地珍稀葡萄品种成为了重要的应对策略。这些品种的酿酒学适宜性，很大程度上取决于其糖苷化香气前体的特征。传统上，通过酸解或酶解释放结合态香气物质的研究方法存在局限性，无法准确反映葡萄果实中原始糖苷化前体的真实组成。本研究以西班牙卡斯蒂利亚-拉曼恰产区的两个本土珍稀白葡萄品种Pintada和Jarrosuelto为对象，在2022年的采收季节，探究了它们在两种不同水分胁迫处理（重度/生存灌溉SI， 中度/亏缺灌溉DI）下，完整糖苷化香气前体的组成，并与该地区主栽的白葡萄品种Airén进行比较。研究的核心假设是：葡萄品种对水分胁迫的适应性会反映在其完整挥发性糖苷的组成变化上。
材料与方法
研究的葡萄样本来自一个位于西班牙卡斯蒂利亚-拉曼恰Tomelloso地区的多品种实验葡萄园。供试品种包括广泛种植的Airén品种，以及两个正在被恢复利用的珍稀品种Pintada和Jarrosuelto。葡萄园采用两种灌溉制度以模拟不同的水分胁迫水平：一种是仅提供生存所需灌溉水的重度胁迫（SI），另一种是维持中度水分亏缺的亏缺灌溉（DI）。通过测定葡萄汁的碳同位素组成（δ13C）来验证和量化水分胁迫状态。
葡萄样品经采收后，立即冷冻处理以备后续分析。糖苷化香气前体的提取与分析参照了先前建立的方法。具体而言，从葡萄果皮和果肉中分别提取代谢物，经纯化、富集步骤后，采用固相萃取（SPE）分离出糖苷化化合物。最终的分析检测使用了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC/QTOF）联用技术，在负离子模式下进行。化合物的鉴定依赖于一个名为“GrapeAroma”的内部葡萄糖苷香气化合物数据库，并通过MS/MS实验进行确认。由于缺乏商业化标准品，本研究采用了相对定量方法，即将各化合物的信号强度归一化至内标物（正庚基葡萄糖苷）的信号强度。数据分析包括双因素方差分析（ANOVA）、t检验以及主成分分析（PCA），以评估品种、水分胁迫处理及其交互作用对香气前体积累的影响。
结果与讨论
糖苷化香气前体的组成与鉴定
在Airén、Pintada和Jarrosuelto三个葡萄品种中，共检测到20种完整的糖苷化化合物，分别属于苯甲酸类、单萜醇类、脂肪族醇类、降异戊二烯类及其他萜类。这些化合物主要以己糖苷和戊糖基-己糖苷衍生物的形式存在。研究采用了基于质谱信号强度的相对定量方法来比较不同品种和处理间的差异。
品种、水分胁迫及其交互作用的影响
双因素方差分析结果显示，对于绝大多数鉴定出的糖苷化香气前体而言，“品种”因素是影响其信号强度变化的最主要因素。相比之下，“水分胁迫处理”仅对少数几种化合物的积累有显著影响，例如二甲氧基苯酚己糖苷、单萜二醇戊糖基-己糖苷、3-甲基-2-丁烯-1-醇戊糖基-己糖苷等。值得注意的是，品种与水分胁迫之间存在显著的交互作用，这意味着不同品种对水分可用性的响应模式存在差异。这一结果与先前关于红葡萄品种的研究结论一致，表明葡萄香气前体的积累主要由基因型决定，而水分胁迫的影响则因品种而异。
糖苷化香气前体的家族响应
通过对不同化合物家族的详细分析，可以更清晰地看到品种间的差异及其对水分胁迫的响应：
- 1.
苯甲酸类：在两种灌溉制度下，Airén品种中的二甲氧基苯酚己糖苷和苯甲酸类前体总量均显著高于Pintada和Jarrosuelto。相反，苯甲醇戊糖基-己糖苷则在两个珍稀品种中含量更高。水分胁迫减少了Airén和Pintada中苯甲酸类前体的总量，但对Jarrosuelto影响不大。这表明珍稀品种，特别是Pintada，可能在水分胁迫下通过激活苯丙烷代谢途径来响应胁迫。
- 2.
单萜醇类：Pintada和Jarrosuelto中的单萜醇类糖苷总量显著高于Airén，这主要归因于芳樟醇、橙花醇和香叶醇的戊糖基-己糖苷，以及羟基芳樟醇/呋喃芳樟醇氧化物己糖苷异构体（在Jarrosuelto中含量特别高）。在重度胁迫（SI）下，两个珍稀品种的单萜醇积累有所增加。而对于Jarrosuelto，适度的水分亏缺（DI）反而促进了芳樟醇和橙花醇戊糖基-己糖苷的合成。单萜醇是赋予葡萄酒花香、果香等优质香气的重要物质，其积累受水分胁迫和品种遗传背景的双重调控。
- 3.
脂肪族醇类：共鉴定出6种脂肪族醇糖苷。Pintada在重度胁迫下，3-甲基-2-丁烯-1-醇戊糖基-己糖苷、3-己烯-1-醇己糖基-己糖苷异构体及脂肪族醇总量的信号强度显著高于Airén。而Airén则在2-丁醇戊糖基-己糖苷和1-己醇戊糖基-己糖苷异构体1上含量更高。Jarrosuelto在适度水分亏缺下，几种1-己醇戊糖基-己糖苷的信号更强。脂肪族醇通常与葡萄酒中的青草味、化学味等负面感官属性相关，其合成与脂氧合酶-氢过氧化物裂解酶（LOX-HPL）通路有关，该通路对水分胁迫的响应具有品种和发育阶段依赖性。
- 4.
降异戊二烯类：共鉴定出3种降异戊二烯类化合物。两个珍稀品种中的紫罗兰醇己糖苷异构体及降异戊二烯类总量均显著高于Airén，尤其是在重度胁迫下。降异戊二烯类由类胡萝卜素氧化降解产生，具有花香、果香特征，且感官阈值低，对葡萄酒香气贡献显著。适度水分胁迫通常有助于这类化合物的形成。
- 5.
其他萜类：主要指香叶酸衍生物。Pintada和Jarrosuelto中香叶酸鼠李糖基-己糖苷的信号强度在两种灌溉制度下均显著高于Airén。在重度胁迫下，珍稀品种的“其他萜类”总量也更高。
水分管理对葡萄糖苷化香气前体的影响
水分胁迫不仅影响游离香气物质的合成，也调节着决定其以游离态还是结合态（糖苷化）存在的糖基化途径。糖基化由糖基转移酶（GTs）催化，能够增强代谢物的稳定性和储存性。研究表明，水分胁迫可诱导葡萄中脱落酸（ABA）的合成，而ABA不仅能调控气孔关闭以应对干旱，还能作为转录调节因子，激活与挥发性物质糖基化相关的糖基转移酶基因的表达。这解释了为什么在某些品种（如本研究中表现为部分等水型的Pintada）中，水分胁迫反而可能导致糖苷化香气前体的积累增加。相比之下，那些表现出极度不等水型（如Airén）或不等水型（如Jarrosuelto）行为的品种，其气孔在胁迫下保持相对开放，维持了初级代谢，但次级代谢（包括香气物质的糖基化）可能因ABA信号和氧化应激水平较低而维持在基线水平或增幅较小。
品种鉴别与糖苷标记物鉴定
主成分分析（PCA）结果清晰地根据品种将样本分为Airén、Pintada和Jarrosuelto三个独立的组群。其中，两个珍稀品种与主栽品种Airén的分离更为明显。对主成分贡献最大的变量包括芳樟醇戊糖基-己糖苷、橙花醇戊糖基-己糖苷（正向）以及二甲氧基苯酚己糖苷、2-丁醇戊糖基-己糖苷（负向），这些化合物是区分品种的关键代谢物。
更有意义的是，研究发现了两种具有品种特异性的代谢物，可作为潜在的化学标记物：
- 1.
C13-降异戊二烯类己糖-己糖衍生物：仅在Airén品种中检测到，其信号强度不受水分胁迫处理的影响。
- 2.
异丙醇戊糖基-己糖苷同分异构体2：仅在Jarrosuelto品种中检测到，且在适度水分亏缺（DI）处理下，其信号强度比重度胁迫（SI）下显著更高。
- at m/z 399.1508 (Jarrosuelto); (b) C13-Norisoprenoid hexose-hexose, precursor ion [M - H]-at m/z 549.2553 (Airén).">
结论
本研究系统评估了水分胁迫下卡斯蒂利亚-拉曼恰产区两个珍稀白葡萄品种Pintada和Jarrosuelto的完整糖苷化香气前体谱。结果表明，香气前体的积累和组成主要受品种遗传因素控制，而水分胁迫的影响则表现出显著的品种依赖性。与主栽品种Airén相比，Pintada和Jarrosuelto展现出更高的糖苷化香气前体积累潜力，尤其在苯甲酸类、单萜醇、脂肪族醇、降异戊二烯类及其他萜类物质上。其中，Pintada在重度水分胁迫下表现出最强的糖苷化前体积累响应。研究首次鉴定出两种品种特异性标记物：一个为Airén独有的C13-降异戊二烯类己糖-己糖衍生物，另一个为Jarrosuelto独有的异丙醇戊糖基-己糖苷同分异构体，这为葡萄品种鉴别、葡萄酒真实性控制以及混酿产品的追溯提供了新的代谢组学工具。综上所述，深入了解葡萄果实中完整糖苷化香气前体的组成，对于准确评估品种的香气潜力及其在缺水条件下的酿酒学适应性至关重要。Pintada和Jarrosuelto等珍稀品种在应对气候变化的背景下，显示出通过品种多样化来提升产区葡萄酒特色和适应性的重要潜力。未来研究需进一步验证这些糖苷化前体在酿酒过程中能够被释放的比例，以全面评估其最终的感官贡献。
