《Clinical Dysmorphology》：Exploring ATP6V1B2-related disorders: a case report-based literature review
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本综述系统探讨了代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的新型无创评估策略。研究通过分析111例MASLD患者的肠道菌群组成与免疫球蛋白G（IgG）亚类（IgG1/IgG2）糖基化特征，构建了能够有效识别重度肝脂肪变（HS）和显著肝纤维化的组合评分模型。结果显示，特定菌属（如Megamonas、Christensenellaceae R-7等）与IgG糖基化比率（如IgG2-N4H5F1/IgG1-N4H5F1、bisected-IgG2/bisected-IgG1等）对疾病严重程度具有显著预测价值，其组合模型的曲线下面积（AUC）分别达到0.776（重度HS）和0.810（显著纤维化），性能不劣于常用的肝脂肪变指数（HSI）和FibroScan-AST（FAST）评分。该研究为MASLD的早期筛查和干预提供了基于多组学标志物的新思路，并提示糖基化修饰可能成为潜在的治疗靶点。
引言
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）已成为美国肝移植候选者和等待者中肝细胞癌（HCC）增长最快的原因。肝活检虽是评估肝纤维化的金标准，但其存在有创性、观察者间差异、并发症风险等局限。现有非侵入性模型如肝脂肪变指数（HSI）和FibroScan-AST（FAST）评分依赖天门冬氨酸氨基转移酶（AST）等易受治疗影响或肝外组织干扰的指标，且FibroScan操作依赖专用设备。因此，亟需不依赖易变指标和操作员的新型评估模型。
近期研究强调了肠道菌群与慢性肝病（CLD）的关联，菌群联合体已显示在HCC早期检测中优于传统甲胎蛋白（AFP）。同时，免疫球蛋白G（IgG）通过N-糖基化进行的翻译后修饰在CLD中受到关注，肝脏是糖蛋白合成的主要器官，会导致糖基化模式改变。尽管总IgG的特定糖基化特征已被确定为MASLD的预测模型，且IgG亚类的聚糖分析显示对CLD肝纤维化有预测潜力，但针对MASLD中重度HS或显著纤维化的IgG亚类糖基化特征研究仍有限。肠道菌群失调和IgG糖基化改变均在慢性炎症疾病的发展中起关键作用，菌群变化可调节全身IgG反应，影响IgG亚类比例向促炎或抗炎反应倾斜。本研究旨在利用IgG糖基化特征和菌群联合体开发组合模型，以识别MASLD中的重度HS和显著肝纤维化。
研究方法
这项横断面研究招募了2023年5月至2024年10月期间在门诊因疑似脂肪肝接受腹部超声检查的20岁以上个体。参与者包括符合组织学或影像学确认的HS且至少具备一项心脏代谢风险因素的MASLD患者。排除标准包括近期使用免疫调节剂、细胞毒性药物、化疗、类固醇或抗生素，以及可能妨碍准确测量的不稳定状况。所有分析均在安全环境下进行，遵循《赫尔辛基宣言》。
通过病历获取参与者病史，根据身高和体重计算体重指数（BMI）。使用瞬时弹性成像（VCTE, FibroScan 630 Expert）评估HS，受控衰减参数（CAP）值≥292 dB/m表示重度HS。之后采集血样进行生化分析，包括IgG糖基化特征鉴定。FIB-4指数计算公式为（年龄[岁] × AST[U/L]）/（血小板[109/L] × 丙氨酸氨基转移酶[ALT, U/L]1/2），≥1.3表示显著肝纤维化高风险。
使用重组蛋白A磁珠从血浆样本中纯化总IgG，采用滤膜辅助样本制备方法进行糖肽分析的溶液内蛋白酶消化。肽样本随后用C18 ziptips清洗，在SpeedVac蒸发器中干燥，并于-20°C保存直至液相色谱/质谱（LC/MS）分析。通过NanoLC-nanoESI-MS/MS在Thermo Orbitrap Fusion质谱仪上进行分析，使用Byonic软件识别糖肽相关聚糖结构，并通过MaxQuant与UniProt人类数据库比对进行蛋白质鉴定。
粪便样本使用PureLink微生物组DNA纯化试剂盒处理，扩增16S rRNA基因的V3-V4区域，原始数据在QIIME 2平台上分析。使用SILVA数据库138.1版进行扩增子序列变体的分类学比对，通过phyloseq和vegan包计算分类学丰度，并利用microbiomeMarker包进行ANCOM-BC2检验的差异类群分析。
研究结果
在164名个体中，111名MASLD患者和29名非MASLD个体被确定用于进一步分析。人口统计学信息和代谢参数总结于附表。在MASLD患者中，按CAP水平分层显示，高CAP组的甘油三酯显著升高，白蛋白水平降低。而基于FIB-4指数的分类显示，高FIB-4组的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、糖化血红蛋白（HbA1c）水平升高，糖尿病患病率更高。低CAP与高CAP组或低FIB-4与高FIB-4组在年龄、性别或其他代谢参数上无显著差异。
研究发现，与非MASLD个体相比，MASLD患者中12种细菌的丰度显著更高。值得注意的是，在MASLD患者中，Eubacterium eligens、Clostridia UCG-014等物种在低CAP（非重度HS）患者中丰度显著更高，被归类为非重度HS相关细菌。相比之下，Megamonas在高CAP（重度HS）的MASLD患者中占主导丰度，被归类为重度HS相关细菌。通过汇总重度和非重度HS相关细菌的得分，建立了预测重度HS的菌群联合体评分。受试者工作特征（ROC）分析显示，预测重度HS的曲线下面积（AUC）为0.731，敏感性0.855，特异性0.571。
在肝纤维化方面，Weisella主要在低FIB-4（非显著纤维化）的MASLD患者中丰度高，而Christensenellaceae R-7、UCG-005等则在高FIB-4（显著纤维化）患者中更普遍。通过汇总非显著和显著纤维化相关细菌的得分，创建了显著肝纤维化菌群联合体评分。ROC分析显示预测显著肝纤维化的AUC为0.773，敏感性0.538，特异性0.864。
附表总结了非MASLD和MASLD个体中的IgG1/2糖基化特征。值得注意的是，MASLD和非MASLD组之间的糖基化特征没有差异，这表明IgG糖基化特征的改变在MASLD的不良血糖/血脂谱中没有作用。在调整年龄和性别后，MASLD患者的低CAP和高CAP组之间在IgG1/2糖基化特征上存在差异。此外，低FIB-4和高FIB-4水平患者在特定IgG1/2糖基化特征上也存在差异。
在低CAP的MASLD患者中，发现了5个非重度HS相关糖基化特征与菌群联合体（特别是Lachnospiraceae ND3007和Monoglobus）之间的正相关。相反，Lachnospiraceae ND3007和Monoglobus与重度HS相关糖基化特征有3个负相关。值得注意的是，Megamonas在低CAP组中与重度HS相关糖基化特征无关，但在高CAP组中与多个特征呈正相关。此外，在高FIB-4患者中，非显著纤维化相关细菌Weisella与非显著纤维化相关糖基化特征IgG2-N4H4F1呈正相关。相反，在低FIB-4组中未观察到相关性。这些结果表明，菌群与糖基化之间的复杂相互作用可能影响HS和显著肝纤维化的发展。
对低CAP和高CAP组中IgG1和IgG2糖基化特征之间相互关系的分析揭示了几种中度到高度的正相关，尤其是在非重度HS患者中。三个呈正相关的糖基化特征在低CAP和高CAP组中保持了一致的相关性：IgG1-N4H3F1与IgG2-N4H3F1、IgG1-N4H5F1与IgG2-N4H5F1，以及bisected-IgG1与bisected-IgG2。
对低FIB-4和高FIB-4组中IgG1和IgG2糖基化特征之间相互关系的分析显示，多个糖基化特征表现出显著相关性。值得注意的是，4个呈正相关的糖基化特征在低FIB-4和高FIB-4组中保持了一致的相关性：IgG1-N4H3F1与IgG2-N4H3F1、IgG1-N4H5F1与IgG2-N4H5F1、bisected-IgG1与bisected-IgG2，以及IgG1-半乳糖基化指数与IgG2-半乳糖基化指数。附表显示，这些比率一致呈正相关的糖基化特征在低/高CAP或低/高FIB-4组之间是不同的，这意味着该比率与不同严重程度的HS和纤维化相关。
聚焦于在低CAP和高CAP组中均一致呈正相关的糖基化特征，对这些比率作为识别重度HS的候选指标进行了评估，其中IgG2-N4H5F1/IgG1-N4H5F1和bisected-IgG2/bisected-IgG1可以识别重度HS。另一个糖基化比率IgG2-N4H3F1/IgG1-N4H3F1则不能识别重度HS。类似地，一致呈正相关的特征的比率，包括IgG2-N4H3F1/IgG1-N4H3F1、bisected-IgG1/bisected-IgG2和IgG1-半乳糖基化指数/IgG2-半乳糖基化指数，可以识别显著肝纤维化。然而，IgG1-N4H5F1/IgG2-N4H5F1不能识别显著肝纤维化。
为评估菌群联合体和糖基化特征对识别MASLD患者中重度HS和显著肝纤维化的整体影响，我们开发了包含重度HS菌群联合体评分和糖基化特征比率的组合评分。对于识别重度HS，如果IgG2-N4H5F1/IgG1-N4H5F1或bisected-IgG2/bisected-IgG1超过各自的截断值，则计1分。重度HS组合评分计算为糖基化特征比率得分与重度HS菌群联合体评分之和。该组合评分的AUC为0.776，高于肝脂肪变指数（HSI，AUC=0.645）。图的校准曲线显示，Hosmer-Lemeshow检验的P值对于检测重度HS和显著肝纤维化的模型分别为0.109和0.797，表明模型拟合良好。
类似地，显著肝纤维化组合评分通过汇总显著肝纤维化菌群联合体评分和糖基化特征比率计算。如果以下任何比率超过其各自截断值，则计1分：IgG2-N4H3F1/IgG1-N4H3F1、bisected-IgG1/bisected-IgG2或IgG1-半乳糖基化指数/IgG2-半乳糖基化指数。如图所示，该组合评分的识别能力与用于显著肝纤维化的FAST评分进行了比较。组合评分的AUC为0.810，高于FAST评分（AUC=0.690）。
除了与现有模型HSI和FAST评分进行交叉验证外，还进行了10次Bootstrap验证的内部验证，显示出良好的AUC曲线。
讨论
近期研究强调了IgG-GlcNAc的相对无半乳糖基化与内脏脂肪沉积之间的联系，而内脏脂肪沉积与MASLD患者的HS和纤维化相关。IgG的低半乳糖基化也与儿科MASLD患者的肝脏炎症有关。我们的研究发现，MASLD患者中IgG2的低半乳糖基化指数与重度HS和显著肝纤维化显著相关。值得注意的是，IgG1和IgG2之间特定的糖基化特征比率成为这些患者中重度HS和显著肝纤维化的潜在预测因子。
菌群联合体的改变与MASLD的发病机制有关。肠道细菌Megamonas丰度的增加与MASLD的发展相关，我们的研究进一步建立了Megamonas与重度HS之间的联系。在本研究中，对MASLD与非MASLD或低CAP与高CAP组进行了类似分析，以探讨肠道菌群对MASLD的临床数据和HS或重度HS的影响。值得注意的是，图中微生物Megamonas与重度HS（高CAP）相关，但在非MASLD组中也比MASLD组更丰富。不同的是，微生物Megamonas的丰度在非MASLD与MASLD组的比较中是一个保护因素，而在重度HS与非重度HS组的比较中是一个有害因素。值得注意的是，微生物Megamonas相对丰度在MASLD与非MASLD组之间的负对数倍数变化小于其在低CAP与高CAP组之间的正对数倍数变化。如附表所示，在非MASLD组中观察到显著更好的血糖和血脂谱。事实上，先前的研究报告称，微生物Megamonas的高丰度与更好的血糖和血脂谱相关。因此，微生物Megamonas可能在血糖/血脂谱和HS中具有不同的作用。
先前研究表明，Eubacterium和Lachnospiraceae水平降低与HS相关；我们的研究结果支持这些物种随着HS严重程度的进展而减少。此外，肠道菌群联合体的变化与MASLD中肝纤维化的进展相关。我们确定了特定的菌群联合体以及糖基化特征比率作为MASLD严重程度，特别是重度HS和显著肝纤维化的潜在预测因子。
在我们的研究中，IgG亚类的糖基化特征与重度HS和显著肝纤维化显著相关。针对糖基化的干预措施已在抗癌疗法中进行探索，正在进行的临床试验评估其疗效。与我们的发现一致，菌群联合体在各种炎症条件下影响IgG糖基化。此外，通过粪便微生物群移植改变菌群联合体已显示出通过改变血清N-糖基化模式来减轻慢性炎症的潜力。因此，通过基于益生菌改变肠道菌群联合体来修饰IgG糖基化，可能减轻HS和脂肪性肝炎。
与已建立的预测模型如HSI和FAST评分相比，我们的组合模型在预测我们队列中的重度HS和显著肝纤维化方面表现出相当的效果。值得注意的是，HSI和FAST评分中的血清AST水平对肝脏疾病缺乏特异性，并可能受到多种因素的影响。HSI在区分重度脂肪变方面存在局限，并可能受到并发纤维化的干扰。此外，对专用设备（如FibroScan）的需求使FAST评分测量复杂化。基于FibroScan的肝脏硬度（kPa）诊断对MASLD患者晚期纤维化的准确性仍存在争议。事实上，肝纤维化（胶原纤维沉积）是逐渐发展的，而非线性的。在早期阶段，纤维沉积速度较慢。或者，在晚期CLD期间，纤维沉积以更高的速度（指数级）发生。因此，肝脏硬度（kPa）测量和参考标准的准确性可能受到这些非线性差异和胶原蛋白随机积累的负面影响。
相比之下，我们的组合评分仅依赖于可获取的血清和粪便样本，并允许同时检测重度HS和显著肝纤维化，便于更容易地收集和全面评估MASLD严重程度。
本研究有几个局限性，主要关注主要IgG亚类（特别是IgG1和IgG2）的糖基化。未来研究应调查IgG3和IgG4糖基化，以提供更全面的理解。此外，MASLD与非MASLD以及高CAP和低CAP组之间的饮食成分在热量、纤维摄入、加工食品等方面可能不同，这可能会影响组间肠道菌群的差异。因此，未来研究需要探讨饮食成分对各组肠道菌群的影响。尽管FibroScan存在成本和可及性限制，但由于不同实验室的能力差异和保险适用性，粪便菌群和血清IgG糖基化分析在临床上也不容易获得。但本研究的初步结果仍可作为进一步探索肝纤维化的药理学和发病机制的基础。
在我们的研究中，与现有模型的交叉验证、10次内部验证以及校准曲线证实了该模型在识别MASLD病例中重度HS和显著肝纤维化方面的准确性。然而，有限的样本量阻碍了验证队列的纳入，并且估计功效中等，效应量为0.65，需要在后续大规模研究中进一步对这些模型进行外部验证。尽管存在这些局限性，我们的研究结果确立了IgG糖基化特征与MASLD严重程度之间的显著关联，并通过校准曲线得到证实，强调了糖基化修饰作为有前景的治疗途径的潜力。
结论
本研究证明了利用粪便菌群和血清IgG亚类糖基化特征的组合模型的潜力，这些模型在识别重度HS和显著肝纤维化方面不劣于传统模型。此外，该研究强调了糖基化修饰作为MASLD潜在治疗方法的可能性。
