《Frontiers in Immunology》：Sex-associated transcriptional changes to synovial macrophages in the aging joint
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这篇研究论文（Research Article）利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合细胞表面蛋白检测（CITE-seq），系统比较了不同年龄和性别的C57BL/6小鼠滑膜巨噬细胞的组成和转录异质性，揭示了其在衰老过程中保守及性别特异性的变化规律。研究定义了五个主要亚群，并发现Ly6C+浸润性巨噬细胞比例在衰老中增加，而CX3CR1+衬里层巨噬细胞减少。MHCII+巨噬细胞比例的变化呈性别二态性。转录组分析揭示了电子传递链信号通路的保守性上调以及MAPK信号通路在雌性小鼠Ctsk+巨噬细胞中的下调。研究结果为理解巨噬细胞异质性如何以性别依赖的方式随年龄变化提供了见解，并为探究其在骨关节炎（OA）、类风湿关节炎（RA）等年龄相关疾病中的角色奠定了基础。
摘要
巨噬细胞是所有滑膜关节中组织稳态和免疫平衡的关键维持者。然而，其功能会随着年龄增长而受损，导致关节对慢性炎症和关节炎的易感性增加。本研究旨在通过比较年轻与年老、雄性与雌性小鼠关节中滑膜巨噬细胞的转录异质性，来更好地理解衰老的影响以及性别所扮演的角色。
引言
滑膜巨噬细胞是维持关节健康、组织稳态和结构完整性的核心。它们既能驱动与关节炎相关的关节炎症发展，也会导致软骨降解。年龄是骨关节炎（Osteoarthritis, OA）的主要风险因素，而类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）和OA在女性中更为普遍。衰老的巨噬细胞表现出功能受损、炎症特征增强，并广泛涉及多种年龄相关疾病。它们吞噬、代谢、抗原呈递和清除衰老细胞的能力随年龄下降，并在“炎性衰老”（inflammaging）——即与衰老相关的慢性低度炎症——中扮演关键角色。此前，关于滑膜巨噬细胞在衰老过程中异质性的研究尚属空白。
方法
研究使用了约8个月（年轻）和22个月（年老）的C57BL/6雄性和雌性小鼠。通过酶消化法从小鼠双踝关节分离细胞，并通过流式细胞分选（FACS）分选出活的CD45+CD11B+CD4/8/19/NK1.1-Ly6G-SiglecF-CD64+巨噬细胞。利用CITE-seq（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing）技术，即10x Genomics单细胞RNA测序与细胞表面蛋白检测结合，生成单细胞文库。数据分析使用Seurat等生物信息学工具，进行细胞聚类、差异基因表达分析、通路富集分析（使用MSigDB数据库的1730条经典通路基因集）以及拟时序轨迹分析（使用Monocle3）。
结果
1. 滑膜巨噬细胞包含五个主要亚群
研究共分析了16,316个细胞，其中97.56%为巨噬细胞谱系。根据RNA和表面蛋白标志物表达，将滑膜巨噬细胞注释为五个主要亚群：Ly6C+浸润性巨噬细胞、MHCII+单核细胞来源巨噬细胞、CX3CR1+衬里层巨噬细胞、CD163+间质巨噬细胞，以及表达组织蛋白酶K（Ctsk+）的破骨细胞样巨噬细胞。
2. 滑膜巨噬细胞组成的年龄相关差异具有性别依赖性
在衰老过程中，滑膜巨噬细胞亚群比例的变化在不同性别间既有保守性也有特异性。在雄性和雌性小鼠中均观察到，Ly6C+浸润性巨噬细胞比例显著增加，而CX3CR1+衬里层巨噬细胞比例显著减少。性别特异性变化体现在：Ctsk+巨噬细胞仅在衰老雄性小鼠中显著增加；间质巨噬细胞比例仅在衰老雌性小鼠中显著减少；最为有趣的是，MHCII+巨噬细胞的比例变化呈现相反的性别趋势——在衰老雌性小鼠中增加，而在衰老雄性小鼠中减少，这种差异主要由表达精氨酸酶1（Arg1+）的细胞驱动。雌性衰老小鼠巨噬细胞的细胞间异质性显著增加，而雄性则无显著变化。2 fold change and significance levels depicted. D. Stacked bar chart illustrates proportions of interstitial macrophages with specific markers across groups. E. Stacked bar chart details MHCII+ macrophage proportions with Arg1+ and Arg1- markers in each group.">
3. 衰老伴随电子传递链通路上调与MAPK信号通路下调
转录组分析显示，年龄相关的差异基因表达在间质和衬里层巨噬细胞中最为显著。年龄相关基因表达变化在多个生物学通路中显著富集。在雌雄两性的间质巨噬细胞以及雌性的MHCII+巨噬细胞中，电子传递链（Electron Transport Chain）信号通路相关基因显著上调，信号主要由复合物I和IV基因表达增加驱动。相反，多个通路在大多数亚群中呈现下调趋势，但仅在雌性小鼠的Ctsk+巨噬细胞中，受体酪氨酸激酶、死亡受体、MAPK（Mitogen-Activated Protein Kinase）信号通路等被显著富集于下调基因中。在雄性小鼠的Ly6C+巨噬细胞中，氧化应激基因显著上调。MHCII+亚群在雌雄小鼠间的基因表达变化呈负相关，以Arg1、Slc7a2和Retnla等基因的表达变化不一致为主导。
4. 滑膜巨噬细胞分化呈现多条不同的拟时序轨迹
以Ly6C+巨噬细胞为起点的拟时序分析揭示了四条终止于不同巨噬细胞亚群和Ctsk+巨噬细胞的分化轨迹。在浸润滑膜后，所有巨噬细胞的Ly6c2表达下降，H2-Eb1表达短暂增加。在MHCII+巨噬细胞内，分化分叉为以Cx3cr1表达为终点的衬里层巨噬细胞，以及以Retnla、Aqp1和Ctsk表达为标志的间质和Ctsk+群体。在来自衰老雄性和雌性小鼠的滑膜微环境中，观察到巨噬细胞在早期拟时间点密度增加，而在不同轨迹的关键过渡点密度减少，包括从浸润性巨噬细胞向Retnla表达细胞分化的过程在衰老的两性小鼠中均有所减弱，这可能表明衰老关节中存在巨噬细胞分化缺陷。
讨论
本研究利用单细胞技术揭示了衰老过程中滑膜巨噬细胞的异质性变化。研究证实了衰老关节中巨噬细胞库存在性别依赖性的转变。Ly6C+巨噬细胞的增加与衰老组织中单核细胞来源巨噬细胞比例增加的趋势一致，可能反映了浸润率增高或分化轨迹受损。MHCII+巨噬细胞比例的性别二态性变化与Arg1表达细胞相关，这与已知的巨噬细胞性别差异研究相符。Ctsk+破骨细胞样巨噬细胞仅在雄性中随衰老增加，而雌性衰老个体中该细胞的MAPK等信号通路下调，这可能与OA中观察到的性别差异有关。拟时序分析提示衰老关节中稳态巨噬细胞（如RELM-α+）分化存在缺陷，可能助长了慢性低度炎症。
局限性与展望
本研究存在一定局限性，包括单细胞技术本身无法确定细胞绝对数量的变化、酶消化可能对特定亚群回收率产生影响、样本量（尤其是雌性组）相对较小、以及样本混合处理限制了评估个体间变异的能力。未来需要更大样本量、保留生物学重复的研究，并需要结合表观基因组学、功能实验（如吞噬能力、细胞因子产生、线粒体呼吸）以及循环单核细胞的平行分析，来进一步阐明衰老导致关节巨噬细胞功能失调的机制，从而为理解人类年龄相关关节炎的发病机制提供更多线索。
