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这篇研究为视觉系统的“编码-映射”机制提供了新的生理学证据。通过in vivo记录，作者首次在功能水平证明，小鼠视束(RGCs轴突通路)仅维持全局性、粗尺度的地形图，而非精细的局部视网膜拓扑结构。这一发现挑战了“精细拓扑映射存在于整个视觉通路”的传统假设，揭示了长程投射在轴突水平上可容忍一定程度的“混乱”，而精细映射是在各靶区（如外侧膝状体LGN）局部重建的。这为理解神经环路发育与功能组织的稳健性提供了新视角。
Abstract
视网膜拓扑映射是视觉系统的一个基本组织原则，即相邻神经元表征视觉空间中相邻的点。这种空间关系是通过视网膜到外侧膝状体(LGN)再到视皮层的连续脑区之间的精确解剖连接建立的。为了在长程投射轴突本身中检验这种地形图排列的精确性，我们记录了小鼠视束中的视网膜神经节细胞轴突并映射了它们的感受野。正如视网膜拓扑映射脑区的预期那样，我们发现相邻的LGN细胞对的感受野距离显著小于较远的细胞对。相比之下，在视束的RGC轴突中未观察到这种关系。建模分析进一步证实，在视束中观察到的感受野距离与任何局部视网膜拓扑排列都不兼容。相反，视束仅保留了粗略的地形图，与理想的视网膜拓扑组织相比存在约18°的感受野偏差或约40μm的轴突位移。这些结果证明，小鼠视束缺乏精细尺度的视网膜拓扑映射，仅维持宽泛的地形结构。
Introduction
脊椎动物的视觉系统通过地形投射维持从视网膜到下游视觉区域的空间关系。这种视网膜拓扑映射在发育早期出现，并为视觉处理提供了基本平台，确保视觉空间中邻近的点由相邻的神经元群体表征。在小鼠中，视网膜神经节细胞投射到超过40个脑区，几乎所有轴突在分叉到达上丘和外侧膝状体等目标之前，都经过相同的通路——视神经、视交叉和视束。虽然这些下游区域的视网膜拓扑映射已被充分表征，但RGC长程轴突本身在多大程度上保持了视网膜拓扑映射仍不清楚。
之前的解剖学和示踪研究表明，视网膜拓扑映射在视神经中大体保留。来自特定视网膜象限的轴突在视神经内占据一致的位置，在离开眼睛时形成了视网膜几何形状的可靠映射。然而，这种地形图组织在视交叉处被显著打乱，来自双眼的轴突在此交叉并分布到同侧或对侧。因此，视交叉被认为是一个排序中枢，在此视网膜拓扑映射被放松，以允许基于分子线索、中线交叉决定和最终目标特异性路径的重组。穿过视交叉后，RGC轴突通过靶前排序在视束中重组并部分恢复视网膜拓扑映射。这表明在到达目标之前，视束中存在粗略的视网膜拓扑映射；然而，关于这种重组的精确性和功能后果仍存在问题。
Results
在具有视网膜拓扑映射的脑区，根据定义，相邻细胞具有相邻的感受野，表征视觉空间中的邻近点。为了检验视束是否具有视网膜拓扑映射组织，我们因此在活体小鼠的视束中记录RGC轴突的细胞外电活动，并使用白噪声刺激和反向相关性来映射它们的感受野。作为阳性对照，我们也在已知具有视网膜拓扑映射的主要视网膜接收区——背侧LGN进行了记录。
使用多通道硅探针，我们同时从视束记录了6±4个单单元，从LGN记录了17±16个单单元。我们发现，来自视束记录的单单元的测量感受野广泛分布在视觉刺激区域。即使对于那些在同一记录点具有最大信号、因此推测在记录点附近彼此靠近的单元也是如此。相比之下，LGN细胞的测量感受野在空间上更聚集，并表现出显著重叠，尤其是在相邻细胞之间，这与已知的视网膜拓扑映射一致。这种定性比较已经表明小鼠视束缺乏视网膜拓扑映射。
为了进行定量群体水平数据分析，我们研究了感受野距离与同时记录的单元之间物理距离的关系。我们首先使用电极距离作为单元间距离的代理，发现LGN存在显著的正相关，但视束不存在。接下来，我们比较了附近细胞对和远处细胞对，其中附近细胞对被定义为在同一记录点具有最大信号的那些单单元，而远处细胞对则是在不同记录点具有最大信号的单单元。在LGN中，附近细胞对的测量感受野距离显著短于远处细胞对。然而，在视束中，附近细胞对和远处细胞对之间的感受野距离没有差异。因此，小鼠视束中相邻的RGC轴突并不必然代表相邻的视觉位置。
为了进一步评估这一点，我们在假设存在视网膜拓扑映射的前提下，模拟了附近细胞对的预期感受野距离。对于LGN，蒙特卡洛模拟得出的附近细胞对感受野距离估计值在4.2°到4.9°之间，这与测得的感受野距离一致，验证了我们的建模方法。将相同逻辑应用于小鼠视束，我们的模型预测，如果RGC轴突是按视网膜拓扑映射排列的，附近细胞对的感受野距离中位数为7.9°–10.7°。这与测得的感受野距离不一致，从而拒绝了作为模型关键前提的视网膜拓扑映射的存在。
小鼠视束在多大程度上保留了地形图组织？为了解决这个问题，我们扩展了我们的模型，通过对模拟的RGC轴突的感受野位置引入加性高斯噪声，其中σ=1对应于所表示的整个视场。然后，我们使用肯德尔的τ作为空间单调性的度量来量化视网膜拓扑映射的程度，其中τ=1和0分别代表精确和无视网膜拓扑映射。正如预期，视网膜拓扑映射水平τ随着噪声水平σ的增加而降低，附近RGC轴突的估计感受野距离随之扩大。从测量和模拟的感受野距离的交点，我们确定小鼠视束具有中度的视网膜拓扑映射水平，其中τ=0.49，对应的感受野位置与理想的视网膜拓扑位置偏差约18°，或等效地，RGC轴突位移约40μm。这表明小鼠视束缺乏局部的视网膜拓扑映射，但在全局层面维持了地形图组织。
Discussion
在此，我们提供了活体电生理学证据，表明小鼠视束缺乏局部视网膜拓扑映射。群体水平分析和数据驱动的模型都未能在视束中识别出精细尺度的地形图组织，这种组织会使相邻的RGC轴突编码视觉场中的相邻位置。相比之下，对背侧LGN的相应分析支持了先前研究预期的视网膜拓扑映射的存在，从而为我们的功能环路表征提供了对照。
我们承认我们结果中的几个注意事项。首先，视束主要由RGC轴突组成，但也包含来自其他来源的轴突，例如旁臂旁核和上丘。我们的生理学标准可能不足以完全排除这些非目标轴突。其次，虽然视束在很大程度上混合形成了广泛的视网膜拓扑映射，但RGC轴突根据细胞类型和投射目标存在部分和渐进式的分离。我们的模型没有纳入这种类型学，因此可能低估了视束中实际的视网膜拓扑映射程度。另一个注意事项是，相邻RGC轴突的郎飞结偏移可达约70μm；因此，它们可能不会在同一记录点被检测到。尽管如此，我们定义为“附近”的单元仍应接近给定的记录点，因此如果它们不是最接近的，也彼此靠近。这保证了我们数据/模型分析的有效性和稳健性。
我们发现小鼠视束中的RGC轴突仅保留了粗略的视网膜拓扑映射，这暗示了早期视觉通路组织的一个基本约束：即，靶前轴突排序无法在长距离上建立精确的空间关系。这与已知的轴突引导机制的局限性一致，例如Eph/ephrin信号和轴突成束，这些机制建立了广泛的地形梯度，但缺乏单轴突精度所需的分辨率。因此，精细的视网膜拓扑映射必须通过活动依赖机制在每个目标区域内重新建立，这些机制包括视网膜波和赫布可塑性，以便在粗糙的输入上施加局部精度。
这种两步架构可能反映了一种自适应的环路组织原则：通过放松长程布线约束，系统降低了发育成本，同时增加了稳健性。视束中小的位置偏差因此影响最小，因为最终的映射是在各个目标中局部精炼的。此外，每个区域仍然可以自由地优化其自身的视网膜拓扑映射以满足其计算需求，而不是依赖于传入轴突本身的几何排列。在视觉系统中测试这些功能含义，并检查它们是否扩展到整个中枢神经系统，将是未来研究的一个重要方向。
Materials and methods
未使用统计学方法预先确定样本量。除非另有说明，所有分析的显著性水平均为0.05。所有实验均在意大利卫生部许可下进行，并遵循欧洲分子生物学实验室机构动物护理和使用委员会批准的方案。数据分析使用Python和MATLAB完成。
动物
动物饲养在12小时明暗周期下，自由摄取水和食物。总共使用了50只雌性野生型小鼠，年龄在4-19周龄，用于活体电生理记录。
In vivoelectrophysiology
活体电生理记录如前所述进行。简言之，我们首先在动物头部植入头板，用于在活体电生理记录期间固定头部。记录当天，我们首先将受试动物头部固定在记录装置中，并使用机器人立体定位系统确定电极插入目标区域的路径。然后，动物被短暂麻醉，在头骨上钻孔。撤除麻醉后，涂有荧光染料的急性硅探针以5μm/s的速度降低，直到在目标区域发现视觉反应。然后呈现一系列视觉刺激进行记录。
记录后，对电极位置进行组织学验证。在灌注和固定后，检查脑组织冠状切片以可视化探针留下的染料痕迹。
Visual stimulation
视觉刺激如前所述呈现。简言之，视觉刺激被投射到距离动物左眼约20厘米的球形屏幕上，覆盖其约四分之一的视场。使用经过伽马校正的数字光处理设备作为光源。对于感受野映射，呈现了15分钟的黑白二元噪声刺激，由32×18像素的棋盘格图案组成，每个像素以60Hz的频率随机独立闪烁，同时保持每帧的总亮度恒定在平均强度。
Data analysis
我们采用先前建立的尖峰排序和数据分析方法。简言之，我们使用Kilosort 2.0对尖峰进行排序。然后通过在主成分空间中进行聚类并使用Phy进行可视化及手动数据清理来识别单单元。只保留了那些平均尖峰波形和自相关图具有最小1毫秒不应期的单元用于后续分析。
对于视觉感受野分析，我们采用了刺激集统计技术。具体来说，我们首先通过计算“棋盘格”刺激的尖峰触发平均值来获得每个记录细胞的线性时空感受野。作为一个质量度量，我们针对零假设计算了每个体素的p值。对于那些在任意体素上p值小于10-5的单元，我们进行奇异值分解以获得时间和空间滤波器，分别假设RGC/LGN的时空感受野是可分离的。然后，我们将一个二维高斯包络拟合到那些具有单一、独特和局部特征的空间滤波器上；并认为高斯的中心即为感受野中心位置。没有或很少视觉反应的单单元被排除为非目标细胞。对于视束记录，我们还应用了15°的感受野大小阈值来排除来自上丘宽场细胞的轴突。最终，我们获得了60个ON型RGC、133个OFF型RGC、137个ON型LGN细胞和155个OFF型LGN细胞的数据。
近似地，在短距离内，细胞外信号的幅度与细胞和探针之间的距离成反比。因此，我们认为，如果它们都在探针的同一记录点上具有最大的尖峰波形，则记录的单元物理位置接近；而如果它们在不同记录点上具有最大的尖峰波形，则位置较远。使用这些标准，我们识别了同时记录的附近和远处单单元对，并在群体水平上使用曼-惠特尼U检验比较了它们的感受野中心位置之间的距离。
Model analysis
我们使用蒙特卡洛方法来获得附近细胞对的预期感受野距离分布，给定视网膜拓扑映射梯度g。具体来说，我们首先在一个球体中随机采样两个点，其中半径r代表可靠记录单单元的细胞外电极的最大距离。如果两点之间的距离D大于由于神经元物理体积引起的排除阈值d，那么我们将位于这两个采样点的两个神经元之间的感受野距离估计为D × g。我们将此过程重复1000 × n次，以计算估计感受野距离的概率分布函数，以及中位数的95%置信区间。对于小鼠视束，我们使用了r = 20μm作为记录范围，d = 2μm代表RGC轴突直径，g = (表示的视场)/(视束直径) = 135°/300μm。对于小鼠LGN，我们使用了r = 40μm作为记录范围，d = 10μm代表胞体大小，g = 0.11°/μm。
为了对不同视网膜拓扑映射水平的小鼠视束进行模拟，我们在模拟的感受野位置上添加了从高斯分布N(0, σ2)中抽取的噪声，其中σ=1对应于所表示的整个视场，或等效地，小鼠视束的全宽。模拟在σ = [0, 0.5]范围内以0.05为步长进行，除了我们在视觉刺激区域内随机采样一个探针位置，并在距离d内随机采样两个点，如果由于添加的抖动导致这两个采样点上的任何细胞的感受野位于视觉刺激区域之外，则剔除该次试验。随着抖动的增加，模拟的感受野距离增加，地形图表现出更大的无序。为了量化视网膜拓扑映射的水平，我们使用肯德尔的τ作为空间单调性的度量，其中τ=0表示没有视网膜拓扑映射的随机映射；τ=1表示完美的视网膜拓扑映射。然后，利用测量和模拟的感受野距离的交点来估计小鼠视束中视网膜拓扑映射组织的水平。
