《Frontiers in Endocrinology》：Preliminary lipidomics and transcriptomics reveals stage-specific dynamic metabolic patterns from menopause transition to postmenopause
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本综述基于脂质组学与转录组学技术，系统性分析了绝经前、围绝经期过渡（MT）及绝经后女性的临床指标、脂质代谢与白细胞转录组特征。研究发现，从围绝经期过渡到绝经后，体内呈现显著的阶段特异性脂质代谢与基因表达差异，其中围绝经期过渡阶段是脂质代谢重编程的关键时期。E2与多种脂质分子（如PC、PE、Hex1Cer）及核心基因（如CMPK2、MX1、RSAD2、IFI6）显著相关，揭示了内分泌变化驱动代谢与免疫炎症通路（如NF-κB、PPAR信号通路）重塑的潜在机制，为预警和干预绝经相关健康问题（如心血管疾病、骨质疏松）提供了新见解。
引言
围绝经期标志着卵巢功能衰退和下丘脑-垂体-卵巢轴失调的过渡时期，导致激素波动和更年期综合征（MPS）的出现。症状如潮热、盗汗、失眠和情绪障碍严重影响生活质量。此外，MPS与慢性疾病风险增加相关，包括心血管疾病、糖尿病、骨质疏松和乳腺癌。术语“围绝经期”已取代“绝经”，以更准确地描述月经停止前后的生理过渡。它分为三个不同阶段：绝经前（过去12个月月经周期规律）、围绝经期过渡（过去12个月月经周期≤12次）和绝经后早期（连续12个月无月经）。世界卫生组织（WHO）将此期定义为卵巢滤泡功能下降的时期，以雌激素和孕激素水平显著降低及相关症状出现为标志。围绝经期通常发生在40至60岁之间，大多数女性在50岁左右过渡。
脂质代谢改变已被确定为导致围绝经期相关疾病发病机制的关键因素。虽然先前的研究探讨了绝经前后的代谢变化，但许多研究将围绝经期和绝经后阶段合并在一起，忽视了每个阶段的独特代谢特征。多组学技术的进步使得脂质组学和转录组学的整合成为可能，为研究从围绝经期过渡到绝经后的分子机制提供了新工具。尽管取得了进展，但很少有研究结合脂质组学和转录组学来全面表征围绝经期过渡期间的代谢重编程及其潜在的分子驱动因素。
本研究系统分析了绝经前、围绝经期过渡和绝经后三个阶段的脂质组学和转录组学特征。利用脂质组学识别关键脂质分子，同时转录组学揭示了脂质代谢相关基因的功能变化。此外，我们检查了脂质分子、激素水平和基因表达之间的关系。我们的研究结果为围绝经期代谢重塑的分子机制提供了新的见解，并为针对围绝经期相关病症的个性化治疗策略奠定了基础。
材料与方法
研究人群
本研究纳入了处于绝经前、围绝经期过渡和绝经后阶段的女性，根据严格的纳入和排除标准进行筛选，以确保数据的代表性和可靠性。参与者于2023年7月至2024年7月期间从南京市中医院招募。根据STRAW + 10标准，以月经史为主要标准，激素水平为支持数据，将参与者分为三组。定义如下：绝经前组：年龄25-45岁，过去12个月月经周期规律（≥12次/年）。围绝经期过渡组：年龄45-55岁，过去12个月月经周期不规则（≤12次）。绝经后组：年龄50-65岁，连续≥12个月无月经。这些范围反映了STRAW + 10推荐的生物学分期界限，而非人为的年龄匹配。虽然绝经阶段和实际年龄存在生物学相关性，但参与者分层主要基于STRAW + 10的内分泌和月经标准，而非年龄匹配，以强调内分泌状态。尽管如此，残留的年龄相关混杂因素无法完全排除。
进一步的纳入标准要求确认血清激素水平，包括雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH），以支持分期。排除标准包括：严重内分泌或代谢疾病；近期使用激素疗法；使用影响代谢的药物。共招募了90名女性（每组30名）。样本量估计基于初步非靶向脂质组学数据，功效分析表明每组至少27名参与者可实现>80%的统计功效。因此，每组招募30名参与者以容纳潜在的变异性并确保分析稳健性。
数据收集
在体检期间收集基线临床数据，包括年龄、身高、体重和身体质量指数（BMI）。在上午8:30至10:00之间采集空腹静脉血样本，以尽量减少昼夜节律和饮食对代谢指标的影响。所有样本均在南京市中医院中心临床实验室使用标准化方案进行分析。血清E2、FSH和LH水平使用标准化的化学发光免疫测定法测定。空腹血糖（FBG）、总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）和白细胞计数（WBC）作为常规临床血液检查的一部分进行分析。
样本收集与处理
对于转录组学分析，我们基于激素水平分布、人口统计学一致性和临床相似性，选择了每组12个代表性样本（总计n=36）。在采集前对试点样本使用DESeq2进行的饱和度测试表明，此数量足以在错误发现率（FDR）<0.05的水平上捕获稳定数量的差异表达基因。在无菌条件下采集静脉血样本，分离血清用于脂质组学分析，分离白细胞用于转录组学分析。血清样本在-80°C储存，白细胞样本在RNA稳定溶液中保存，然后在-80°C储存用于后续分析。
脂质组学分析
样本制备：总共90份血清样本（每组30份：绝经前/Pre、过渡期/Trans、绝经后/Post）经过蛋白质沉淀和超声处理以确保代谢物完全释放。处理后的样本进行真空离心、干燥和重构用于分析。
脂质组学平台：使用超高效液相色谱（UPLC）-Orbitrap质谱平台进行非靶向脂质组学分析。使用LipidSearch软件对脂质进行鉴定和定量。仪器包括Q-Exactive Plus质谱仪、Nexera LC-30A UPLC和Waters ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱。样品用甲醇-乙腈溶剂处理，并以随机顺序进样分析以减轻信号变异。
色谱和质谱条件：色谱分离在45°C的C18柱上实现，流速为300 μL/min。使用流动相A（乙腈-水，含0.1%甲酸和0.1 mM甲酸铵）和B（乙腈-异丙醇，含0.1%甲酸和0.1 mM甲酸铵）进行梯度洗脱。质谱分析在正离子和负离子模式下进行，分辨率分别为70，000（MS1）和17，500（MS2）。
数据处理：使用LipidSearch进行峰提取、脂质鉴定、比对和定量。分析包括：脂质分类和组成分析（通过条形图和饼图可视化）；使用Mfuzz软件对脂质表达模式进行聚类；使用火山图和热图进行差异脂质分析；使用维恩图比较组间特异性和共享脂质；使用多变量分析（主成分分析/PCA、偏最小二乘判别分析/PLS-DA和正交偏最小二乘判别分析/OPLS-DA）可视化组间分离。
质量控制与批次效应评估：通过每10次进样分析一次由所有血清样本等量混合制备的合并质控（QC）样本，以监控平台稳定性。使用内标和代表性脂质种类的相对标准偏差（RSD）评估分析性能，>85%的特征显示RSD <15%。QC样本在PCA中紧密聚集，表明重现性高。原始强度值进行了中位数归一化，未观察到明显的批次相关漂移。
转录组学分析
RNA提取与质量控制：使用TRIzol商业试剂盒从每组12名随机选择的参与者中提取白细胞RNA。通过NanoDrop和Qubit评估RNA质量，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。
RNA测序：在Illumina平台上进行RNA测序。使用富集的mRNA构建cDNA文库，然后进行双端测序，每个样本测序深度为20-30百万条 reads。使用HISAT2或STAR将高质量reads比对到人类参考基因组（GRCh38）。
数据处理：使用FASTQC去除低质量reads和接头。使用DESeq2或edgeR进行差异基因表达分析，阈值设为p < 0.05且|log2FC| > 1。进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析以识别生物学功能。使用STRING数据库和Cytoscape软件可视化蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，突出显示关键基因。
相关性分析
根据本数据集的上游结果，选择了12个因子进行相关性分析，以提供一个可解释的、与阶段相关的综合视图。具体包括四个临床指标（E2、FSH、LH、CHOL），因为它们代表了内分泌分期锚点和跨组分析的关键心脏代谢读数。选择了四种脂质分子（TG(24:2_11:4_18:2)+NH4、Hex1Cer(t41:1)-H、PC(18:2e_22:5)+H和PE(18:2e_22:4)+H）作为共享差异表达脂质交集集中的代表性物种，并进一步用于物种水平比较和E2-脂质关联分析。选择了四个基因（CMPK2、MX1、RSAD2、IFI6），因为它们在PPI网络分析中被鉴定为共享枢纽基因，并表现出一致的阶段相关表达变化。根据数据分布应用Pearson或Spearman相关性，显著性设置为p < 0.05。使用GraphPad 9.0和R软件中的热图和散点图可视化结果。
统计分析
所有统计分析均使用R软件、GraphPad Prism 9.0及相关软件包进行。连续变量以平均值±标准差（SD）表示。使用单因素方差分析（ANOVA）评估组间临床指标（如BMI、激素水平、血脂）的差异，随后进行Tukey HSD事后检验。统计显著性设定为p < 0.05。对于脂质组学数据，使用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行降维和组间分离。使用p < 0.01和错误发现率（FDR）< 0.05（Benjamini-Hochberg校正）的组合阈值识别差异脂质物种。使用火山图、热图和维恩图可视化脂质物种差异和重叠。使用DESeq2和edgeR包处理转录组学数据。差异表达基因（DEGs）定义为p < 0.01且调整后FDR（Benjamini-Hochberg）< 0.05的基因。使用clusterProfiler进行功能富集（GO和KEGG）和基因集富集分析（GSEA），并在R中可视化。对于选定激素、脂质和基因之间的相关性分析，根据数据分布计算Pearson或Spearman相关系数。对所有相关性结果应用FDR校正以控制多重检验。在撰写本手稿、创建图表或数据分析时未使用任何AI工具。所有内容均由作者单独生成和验证。为减少方法依赖的分析偏差，无监督和有监督的多变量模型，以及单变量和通路水平分析被并行应用，仅解释在这些互补统计层中观察到的、一致的生物学趋势。
结果
临床指标和激素水平在绝经各阶段的变化
共有90名女性参与研究，根据月经史和激素水平分为绝经前组、围绝经期过渡组和绝经后组（每组30名参与者）。组间在年龄、激素水平和代谢参数方面的差异总结于表1。随着绝经阶段的进展，E2水平降低，而FSH和LH水平升高（p < 0.05）。与绝经前组相比，围绝经期过渡组的体重和BMI更高（分别为p = 0.076和p = 0.025）。白细胞计数（WBC）和空腹血糖（FBG）显示出相对稳定的模式（p > 0.05）。总胆固醇（CHOL）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）水平在围绝经期过渡组和绝经后组均显著高于绝经前组（p < 0.001和p = 0.027）。相反，甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）在各组间无显著差异，表明绝经状态对这些参数的影响有限。
围绝经期过渡和绝经后的脂质类别特征
总共鉴定出46个脂质类别及其相应的脂质物种，其中磷脂酰胆碱（PC，685种）、甘油三酯（TG，625种）、磷脂酰乙醇胺（PE，334种）、神经酰胺（Cer，331种）和鞘磷脂（SM，248种）是最丰富的脂质类别。主成分分析（PCA）显示三组间脂质组学特征明显分离，质控（QC）样本的分布证实了数据的稳定性。环形图说明了三组中脂质类别的组成特征，突出了PC、TG、SM、PE和phSM是五个最普遍的类别。值得注意的是，PE和phSM比例的不同表明组间脂质组学组成存在特异性差异。基于脂质表达模式的趋势聚类分析将所有脂质物种分为九个不同的模块。这些模块捕获了脂质水平跨组的动态变化。一些簇在围绝经期过渡期间显著上调，随后在绝经后下降，而另一些则在绝经后组表现出持续的增加或减少。差异脂质分析揭示了组间脂质类别的显著变化。与绝经前组相比，围绝经期过渡组表现出磷脂酰肌
