基础日粮中添加L-瓜氨酸对西门塔尔母牛繁殖性能、血清代谢物与微生物群落结构的影响

《Frontiers in Microbiology》：Effects of L-citrulline supplementation in the basal diet on reproductive performance, serum metabolites, and microbial community structure in Simmental cows

本文研究探讨了在基础日粮中添加L-瓜氨酸（L-Cit）对西门塔尔母牛繁殖性能的调控作用及其背后机制。研究揭示，L-Cit通过重塑瘤胃和肠道微生物群落（如增加Bacteroidota和Prevotellaceae丰度），上调精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）和三羧酸（TCA）循环等代谢通路，进而显著提升促性腺激素释放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）等血清生殖激素水平，最终有效提高了母牛的发情率和受胎率。

　　

¹引言

L-瓜氨酸（L-Citrulline, L-Cit）是一种首先在西瓜中被发现的非必需氨基酸，属于α-氨基酸家族。在哺乳动物体内，它通过尿素循环参与氨转化为尿素的过程。L-Cit被肠道吸收后转运至肾脏，在精氨基琥珀酸合成酶（ASS）和精氨基琥珀酸裂解酶（ASL）的作用下转化为精氨酸（Arginine），后者通过一氧化氮合酶（NOS）维持一氧化氮（NO）和多胺的合成。作为一种信号介质，NO在调节血管平滑肌松弛、缓解氧化应激、促进卵泡发育、胚胎着床和生殖激素分泌等方面扮演关键角色。先前研究表明，L-Cit补充可改善公羊精液质量、丰富肠道微生物群，并提高血清生殖激素水平和抗氧化能力。然而，L-Cit在反刍动物瘤胃和肠道中的吸收与代谢机制仍不明确。本研究旨在通过多产西门塔尔母牛模型，探究L-Cit的剂量依赖性效应，从宿主代谢通路及肠道与瘤胃微生态角度阐明其在繁殖调控中的作用。

²材料与方法

试验在新疆农旺牧场进行，时间为2024年9月至2025年5月。共选取240头3-4岁、平均体重470±15 kg的多产西门塔尔母牛，随机分为三组，每组80头：对照组（仅饲喂基础日粮）、试验I组（基础日粮+7 g/d/头 L-Cit）和试验II组（基础日粮+14 g/d/头 L-Cit）。所有母牛在试验前通过阴道粘液镜检和B超检查确认无生殖道疾病。试验以首次肌注前列腺素（PG，0.4 mg/头）定义为第0天，L-Cit补充于第3天开始，每隔72小时进行。第10天进行第二次PG注射，第11天停止补充。发情表达通过观察母牛接受爬跨来确认，并在发情后10小时进行人工授精。妊娠诊断于授精后第35天通过B超进行。在试验期间，每组随机选取6头母牛，分别在第1天和第11天晨饲前从尾静脉采集血液样本，用于血清生殖激素（GnRH、FSH、LH、E₂）的ELISA检测。此外，在母牛接受爬跨后10小时采集血液、瘤胃液和粪便样本，用于非靶向代谢组学分析和微生物群落（16S rRNA测序）分析。数据统计分析采用SPSS 27软件，微生物和代谢组学数据通过合作公司的云平台进行分析。

³结果与分析

^3.1对发情率和受胎率的影响

与对照组相比，试验I组的发情率显著提高了12.5%（p<0.05），试验II组提高了5%（p>0.05）。试验I组的发情周期受胎率和总受胎率也均高于对照组和试验II组，但差异未达显著水平。

^3.2对血清生殖激素水平的影响

补充L-Cit后，试验II组血清中促性腺激素释放激素（GnRH）和卵泡刺激素（FSH）浓度较对照组分别显著升高了15.79%（p<0.05）和35.71%（p<0.01）。试验I组的GnRH和FSH水平也有升高趋势，但未达显著水平。黄体生成素（LH）和雌二醇（E₂）水平在组间无显著差异。

^3.3对瘤胃微生物的影响

Alpha和Beta多样性分析表明，L-Cit补充并未显著改变瘤胃微生物的整体多样性和群落结构。然而，在门水平上，试验II组中拟杆菌门（Bacteroidota）的相对丰度最高（52.16%），而对照组中厚壁菌门（Firmicutes）的丰度最高（39.87%）。在科水平上，普雷沃菌科（Prevotellaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）是主要菌科，且在试验I组中丰度较高。在属水平上，普雷沃菌属（Prevotella）、Rikenellaceae_RC9_gut_group和F082_norank在试验I组中尤为富集。差异物种分析显示，对照组与试验组之间有12个微生物类群存在显著差异，包括疣微菌门（Verrucomicrobiota）、Lentisphaeria纲等。

^3.4对肠道微生物的影响

与瘤胃结果类似，L-Cit补充也未显著改变肠道微生物的整体Alpha和Beta多样性。在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）是主导菌门，试验II组中厚壁菌门的相对丰度高达66.24%。在科水平上，颤螺菌科（Oscillospiraceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）和理研菌科（Rikenellaceae）是主要菌科。在属水平上，UCG-005、UCG-010_norank和Rikenellaceae_RC9_gut_group是优势菌属。差异物种分析共鉴定出20个显著差异的微生物类群，包括脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）等。

^3.5对血清代谢物的影响

偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型显示，试验组与对照组的血清代谢物谱能够清晰区分。通过变量重要性投影（VIP）>1且p<0.05的标准，共筛选出345个差异代谢物。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，试验I组中精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）和三羧酸（TCA）循环通路显著上调。试验II组中精氨酸生物合成通路也呈现富集，但差异丰度（DA）分析显示其整体表达趋势为下调。此外，试验I组中与能量代谢和抗氧化相关的通路也被激活。

⁴相关性分析

^4.1瘤胃与肠道微生物的关联

在门水平上，瘤胃拟杆菌门（Bacteroidota）与肠道厚壁菌门（Firmicutes）呈极显著正相关。瘤胃疣微菌门（Verrucomicrobiota）则与肠道拟杆菌门和厚壁菌门呈负相关。在科和属水平上也发现了多个微生物类群间的显著相关性，揭示了瘤胃与肠道微生物群落之间在营养代谢和生态功能上的紧密联系。

^4.2肠道微生物与血清代谢物的关联

多种肠道微生物与血清代谢物存在显著相关性。例如，Synergistota门的丰度与4-甲基儿茶酚呈强正相关。脱硫杆菌门（Desulfobacterota）的丰度与阿维菌素B2b苷元呈显著负相关。特定菌属如UCG-005和Anaerovorax的丰度与山嵛酸（Behenic acid）呈负相关。

^4.3血清代谢物与生殖激素的关联

关键代谢物与生殖激素水平密切相关。顺，顺-3-羧基粘康酸（cis,cis-3-Carboxymuconic acid）的丰度与GnRH和E₂呈显著负相关。氧化海肾荧光素（Oxidized Cypridina luciferin）的丰度与E₂呈显著正相关。嘌呤霉素（Puromycin）的丰度与LH呈极显著正相关。

⁵讨论

瘤胃和肠道微生物生态系统通过微生物易位、代谢物交换和宿主生理调节相互关联。L-Cit补充显著改变了特定功能微生物类群的丰度。在试验I组，瘤胃拟杆菌门（Bacteroidota）丰度增加，该菌门能产生纤维素酶和半纤维素酶，增强粗纤维降解，为发情期提供必需能量。普雷沃菌科（Prevotellaceae）丰度的提升尤为关键，其基因组编码的精氨基琥珀酸裂解酶基因（argG）支持了L-Cit向精氨酸的转化。在试验II组，肠道厚壁菌门（Firmicutes）丰度显著升高，有助于碳水化合物降解和短链脂肪酸（SCFA）前体的产生，为肠道上皮细胞供能并减少有害代谢物积累。尽管微生物整体多样性未变，但L-Cit精准调控了这些功能菌群，避免了高剂量添加剂常导致的菌群紊乱。

微生物群落的变化深刻影响了宿主的代谢状态。KEGG分析显示，L-Cit补充上调了精氨酸生物合成和三羧酸（TCA）循环通路。精氨酸是合成一氧化氮（NO）的前体，而NO是调节下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴、影响GnRH脉冲式分泌以及FSH和LH释放的关键信号分子。TCA循环的增强则促进了ATP的产生，为下丘脑GnRH神经元的脉冲式释放提供了能量支持，同时其代谢中间体α-酮戊二酸可作为表观遗传修饰的底物，激活卵巢中卵泡刺激素受体（FSHR）基因的表达。这些代谢层面的改变直接关联到血清中GnRH和FSH水平的显著升高。

相关性网络进一步整合了微生物-代谢物-激素之间的互作关系。瘤胃拟杆菌门与肠道厚壁菌门的正相关，构建了一个从粗纤维降解到能量转化的高效循环。特定代谢物如氧化海肾荧光素与E₂的正相关，提示了L-Cit可能通过增强抗氧化防御系统来保护E₂的合成免受活性氧（ROS）损伤。综合来看，L-Cit通过“微生物重塑-代谢重编程-激素调控”的级联反应，最终提升了西门塔尔母牛的繁殖效率。

⁶结论

在本研究框架内，日粮补充L-瓜氨酸（L-Cit）调控了西门塔尔母牛瘤胃和肠道中特定微生物类群（如门水平的拟杆菌门、科水平的普雷沃菌科）的相对丰度。这些微生物变化伴随着血清代谢通路的改变，特别是精氨酸生物合成和柠檬酸（TCA）循环通路的上调。这些代谢改变进一步影响了血清生殖激素（GnRH、FSH、LH、E₂）的动态水平。上述综合调控效应最终提高了母牛的发情表达率和受胎率。本研究结果为L-Cit在反刍动物营养策略中的应用提供了理论基础。未来研究可着眼于子宫内膜容受性和胎盘组织学，以深入阐明其影响着床的具体机制。