《Frontiers in Microbiology》：Antibody response induced by structural proteins from Triatoma virus as potential adjuvants in experimental immunisation models
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本研究通过评估Triatoma病毒（TrV）结构蛋白（VPs：VP1、VP2、VP3）作为佐剂，在BALB/c小鼠模型中分别结合利什曼原虫（Leishmania amazonensis）天然抗原或克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）嵌合重组抗原（IBMPs）进行免疫。结果显示，VPs可显著诱导特异性IgG抗体，在利什曼原虫模型中偏好诱导IgG2b和IgG3亚类，而在克氏锥虫模型中则主要诱导IgG2b，并伴随类似水平的IgG2a和IgG3。这表明TrV病毒样颗粒（VLPs）的结构蛋白是一种有前景的佐剂策略，能够调节针对利什曼原虫和克氏锥虫等原生动物寄生虫的疫苗体液免疫应答。
引言
疫苗佐剂是免疫过程中的重要组成部分，它能增强抗原的免疫原性，提高疫苗效力。历史上，铝佐剂（alum）曾被广泛使用，但自20世纪90年代以来，MF59等新佐剂的出现推动了该领域发展。重组蛋白和病毒样颗粒（VLPs）是近年来疫苗开发的重要平台。VLPs由病毒结构蛋白组成，不含病毒遗传物质，但保留了天然病毒的结构和部分病原相关分子模式（PAMPs），因此具有高免疫原性，常被用作佐剂。
美洲皮肤利什曼病（ACL）由利什曼原虫（Leishmania amazonensis）引起，全球约有6亿至10亿人面临感染风险。恰加斯病则由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起，是世界卫生组织（WHO）认定的20种被忽视的热带病之一，全球约7000万人面临感染风险，600-700万人已感染。针对这两种疾病，开发有效疫苗是重要挑战。
本研究团队此前开发了由Triatoma病毒（TrV）三种结构蛋白（VP1、VP2、VP3）组成的重组VLPs（TrV-VLPs），并在小鼠免疫实验中初步验证了其潜力。基于此，本研究旨在更系统地评估TrV-VLPs的三个重组结构蛋白（VP1、VP2、VP3）作为佐剂，分别与L. amazonensis天然抗原或T. cruzi嵌合重组抗原（IBMPs）联用，在BALB/c小鼠模型中诱导体液免疫反应的能力。
结果
2.1 Triatoma病毒结构蛋白（VP1、VP2和VP3）的电泳图谱
通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析了VP1、VP2和VP3重组蛋白的电泳图谱。结果显示，三种蛋白在约30 kDa分子量标记处均有一条主带，表明成功表达并纯化了目标蛋白。
2.2 用L. amazonensis总蛋白提取物和不同疫苗佐剂免疫动物后的抗利什曼抗体谱
用L. amazonensis总蛋白提取物（粗提物）分别与不完全弗氏佐剂（FIA）、铝佐剂（alum）或VPs混合，对BALB/c小鼠进行皮下免疫。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗L. amazonensis的总IgG抗体及其亚类。
首次免疫后15天和30天，所有使用佐剂（FIA、alum、VPs）的免疫组，其总IgG抗体水平均显著高于仅使用粗提物的组和未免疫的阴性对照组。在二次免疫后（第15、30、40、50天），FIA组始终保持着最高的抗体水平。
在首次免疫后60天，进一步分析了IgG抗体亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）。结果显示，VPs免疫组未诱导出显著的抗利什曼IgG1抗体反应，而FIA和alum组则诱导了较高的IgG1水平。在IgG2a方面，FIA和alum组显示出显著反应，而VPs组与仅用粗提物组及阴性对照组相比无显著差异。值得注意的是，FIA、alum和VPs免疫组均诱导了显著的抗利什曼IgG2b抗体。最为突出的是，VPs免疫组诱导了最高水平的抗利什曼IgG3抗体，显著高于FIA、alum和仅用粗提物的组。
2.3 用克氏锥虫（T. cruzi）嵌合抗原和不同疫苗佐剂免疫小鼠后的抗体谱
本研究使用了四种T. cruzi的嵌合重组抗原（IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3, IBMP-8.4）的混合物（Mix），分别与FIA、alum或VPs混合后免疫小鼠。
首次免疫后（第15、30、45天），ELISA检测显示，与Mix单独使用组相比，Mix与FIA或alum联用能显著诱导针对各IBMP蛋白的总IgG抗体。Mix与VPs联用，在部分时间点（如抗IBMP-8.2的15、30、45天，抗IBMP-8.3的15天）也能诱导显著高于阴性对照的抗体反应。
二次免疫后（第15、30、45天），所有组的抗体水平普遍提升。Mix与FIA联用仍然诱导了最高的总IgG抗体水平。Mix与VPs联用在所有时间点对IBMP-8.3蛋白诱导的抗体反应最为显著。
二次免疫后70天，分析了针对Mix-IBMP抗原混合物的IgG抗体亚类。结果显示，无论是Mix单独使用还是与任一种佐剂（FIA、alum、VPs）联用，均未诱导出IgG1抗体。Mix与FIA联用诱导了最高的IgG2a和IgG3水平。Mix与alum联用诱导了与FIA组相似的IgG2b水平，但IgG2a和IgG3水平较低。Mix与VPs联用诱导的IgG2a水平高于alum组，且所有抗体亚类（IgG2a, IgG2b, IgG3）水平均高于Mix单独使用组，其中IgG2b的诱导最为突出。
讨论
本研究结果表明，TrV的结构蛋白（VPs）作为佐剂，能够有效调节针对L. amazonensis和T. cruzi抗原的体液免疫应答。
在L. amazonensis模型中，VPs倾向于诱导IgG2b和IgG3，而非IgG1。在利什曼病中，IgG1通常与Th2型免疫反应和疾病易感性相关，而IgG2a与Th1型反应和寄生虫控制相关。VPs未能显著诱导IgG2a，但其高水平的IgG3诱导值得关注。IgG3在补体激活、细胞毒性和促进CD8+T细胞反应中可能发挥作用，这可能有利于对抗细胞内寄生虫如利什曼原虫。
在T. cruzi模型中，VPs与抗原联用主要诱导了IgG2b，并伴随相当的IgG2a和IgG3水平，同样未诱导IgG1。对于恰加斯病这类细胞内感染，理想的保护性免疫偏向于Th1型反应（与IgG2a相关）。VPs诱导的IgG2b和IgG3具有调理吞噬和激活补体的特性，可能有助于清除病原体。
总体而言，VPs展示出与经典佐剂（如FIA和alum）不同的免疫调节特性。它不倾向于诱导可能与疾病恶化相关的IgG1，而是偏向于诱导IgG2b和IgG3等同种型，这可能为针对利什曼病和恰加斯病的疫苗开发提供一种新的、具有潜在优势的佐剂策略。然而，本研究仅评估了体液免疫反应，未来的研究需要进一步评估其诱导的细胞免疫（如Th1/Th2细胞因子、CD8+T细胞反应）以及在感染模型中的实际保护效果。
材料与方法
4.1 Triatoma病毒重组结构蛋白的获取
TrV的VP1、VP2和VP3基因被克隆到pET3d(+)载体中，在大肠杆菌（E. coli） BL21 (DE3)中表达，并用IPTG诱导。重组蛋白通过尺寸排阻色谱纯化，并通过SDS-PAGE和免疫印迹（使用兔多克隆抗VP1、抗VP2和抗VP3血清）进行表征。
4.2 L. amazonensis前鞭毛体的获取及粗蛋白提取物的制备
L. amazonensis前鞭毛体在添加了10%胎牛血清（FBS）和抗生素的RPMI-1640培养基中，于27°C培养。收集寄生虫，用PBS洗涤，通过反复冻融和机械振荡制备粗蛋白提取物。
4.3 克氏锥虫（T. cruzi）嵌合重组抗原的获取
T. cruzi重组蛋白（IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3, IBMP-8.4）由优化后的合成基因在大肠杆菌中表达，并通过6xHis标签进行亲和层析纯化。
4.4 动物模型免疫
使用雌性BALB/c小鼠进行两个独立的免疫实验。实验一使用L. amazonensis粗蛋白提取物，实验二使用T. cruzi嵌合抗原混合物（Mix）。抗原分别与PBS（无佐剂）、FIA、alum或VPs混合，通过皮下注射进行免疫。具体剂量和分组见文中表格。所有动物实验均遵循伦理指南。
4.5 免疫小鼠血清获取及抗体测定
通过尾静脉采血或心脏穿刺获取血清。采用ELISA方法测定针对L. amazonensis粗提物或T. cruzi重组蛋白的特异性总IgG及其亚类（IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3）的抗体水平。
4.6 统计分析
使用GraphPad Prism软件，通过方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验分析数据差异，p值小于0.05被认为具有统计学显著性。
结论
本研究表明，基于L. amazonensis天然抗原或T. cruzi嵌合重组抗原的免疫方案，在与Triatoma病毒结构蛋白（VPs）联用时，能够诱导特异性的抗体反应。在利什曼原虫模型中，VPs显著诱导了IgG2b和IgG3亚类；在克氏锥虫模型中，则主要诱导IgG2b，并伴有相当的IgG2a和IgG3，且均未诱导IgG1。这些特征提示VPs可能有助于导向一种有利于控制细胞内寄生虫感染的免疫应答类型（偏向Th1）。因此，Triatoma病毒结构蛋白（VP1, VP2, VP3）展现出作为新型疫苗佐剂的潜力，为开发针对美洲皮肤利什曼病和恰加斯病的疫苗策略提供了新思路。但需进一步的研究来全面评估其免疫原性、安全性和在感染模型中的保护效力。
