《Lab on a Chip》：Inkube: an all-in-one solution for neuron culturing, electrophysiology, and fluidic exchange
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本文推荐一款名为"Inkube"的开源一体化系统，它创新性地将细胞培养箱、电生理记录与全自动灌流系统整合，实现了对最多4个微电极阵列（MEA）并行实验的精确环境控制。该系统可独立调控各培养物的温度、渗透压，并自动监测和补充培养基液量，为研究环境变量（如温度、渗透压、pH）对神经元网络放电活动的影响提供了前所未有的稳定平台。其高度自主性使其在药物筛选、可塑性研究等领域具有重要应用价值。
在神经科学研究中，体外培养神经元网络是一项繁琐且耗时的任务。传统的实验装置通常难以在研究电生理活动的同时，精确控制培养基成分及环境变量（如温度、渗透压和pH值）的影响。为了应对这一挑战，研究人员开发了名为“Inkube”的一体化系统。该系统将培养箱、电生理学装置和全自动灌流系统相结合，为核心科学问题——环境变量如何影响神经元活动——提供了创新的解决方案。
系统概述与设计理念
Inkube是一个低成本、模块化的开源硬件一体化解决方案，其核心目标是实现对神经元培养环境的高精度、多参数并行控制。系统围绕一个包含现场可编程门阵列（FPGA）的系统级芯片（SoC）构建，能够对最多4个神经元培养物进行并行刺激和记录，最多可同时处理240个电极的信号。
Inkube系统被设计为一个3D打印的立方体结构，其组件自上而下分为四个功能层：培养层、通风层、电子层和流体层。培养层位于最顶层，容纳最多4个微电极阵列（MEA）、各类传感器和电生理学组件。该层配备了一个3D打印的、用铝箔进行电磁屏蔽的盖子，以减少对电生理记录的电磁干扰。关键传感器包括：用于测量培养箱内空气温度、湿度（SHTC3传感器）和二氧化碳（STC31传感器）浓度的传感器；用于直接测量每个MEA培养基温度的模拟电阻温度检测器（RTD， PT1000）；以及一个名为“inkulevel”的、基于表面反射的高度传感器，用于测量每个MEA的培养基体积。在调控方面，每个MEA下方安装有两个热电帕尔贴器件，可独立于培养箱温度对各个MEA进行加热或冷却。培养箱内的空气温度通过盖内的电阻加热元件控制，湿度则通过一个由3D打印机筒式加热器加热的水浴来控制。
通风层负责引导气流经过帕尔贴元件的散热器，确保系统其他部分的热量管理。电子层是系统的“大脑”，容纳了基于Arty Z7开发板（搭载Xilinx Zynq-7000 SoC）的主控制器、电源板、灌流控制板以及连接板。二氧化碳浓度通过一个阀门控制，由外部高压二氧化碳源（约1.5巴）供气。流体层位于最底层，包含一个用于冷却离心管的干浴（温度稳定在4.5-6.5 °C）以及定制的灌流系统。灌流系统由一个专为Inkube设计的3D打印线性注射泵和4个液体多路复用器组成，能够独立地向每个MEA输送3种不同的培养基或药物，并同时从MEA中抽吸培养基。
关键技术创新：培养基体积精确测量
培养基蒸发会导致渗透压变化，是影响神经元活动可重复性的一个重要但常被忽视的因素。Inkube通过其创新的“inkulevel”模块解决了这一问题。其工作原理是利用激光（入射角60°）照射液体表面，反射光点被一个移除镜头的ESP32-CAM相机模块捕获。通过分析光点在相机传感器上的位置变化（Δx），可以高精度地反推培养基液面高度变化（Δh），理论关系为Δx = 2·sin(β)·Δh。在实际应用中，研究人员通过实验校准了液面高度与相机读数之间的关系，发现在970-1000微升范围内呈良好线性。基于此反馈，系统能够在培养基液面低于设定阈值时自动添加超纯水以补偿蒸发，液面测量精度约为4微升。同时，系统还能执行程序化的培养基更换，例如先移除50微升旧培养基，再加入50微升新鲜培养基。
系统性能验证
Inkube在各项环境参数的控制上表现出色。培养箱的空气温度控制范围可达环境温度以上17°C，二氧化碳浓度控制范围0-28%，湿度控制范围可达环境湿度至72%。对于培养基温度的独立控制尤为精确。每个MEA的RTD传感器直接浸没在培养基中测量，避免了间接测量的误差。在将培养基温度维持在37°C时，约80%的测量值与设定值的偏差在一个最低有效位（约32毫开尔文）以内，所有4个MEA的平均均方根误差（RMSE）约为14.7毫开尔文。系统能够独立控制各MEA的温度，在37°C基准上，可实现±10开尔文范围内的温度变化，且从一个稳态切换到另一个稳态（如37°C到35°C）的调节时间在5分钟以内。
在电生理记录方面，系统使用16个Intan RHS2116芯片进行信号采集，原始信号的输入参考噪声中位数为3.21微伏rms，滤波后为2.41微伏rms，与芯片的预期性能一致。连接灌流路径但未泵液时，噪声几乎不受影响；但在主动泵送大量液体时，噪声会增大约2.5倍。系统支持闭环刺激，若通过主机和Python接口，最小往返时间为10毫秒；若在Cython代码或SoC内部实现闭环，则可达到更快的速度。
应用展示：环境变量对神经元活动的影响
利用Inkube的高精度控制能力，研究人员进行了一系列实验，揭示了环境变量对神经元放电活动的显著影响。
- 1.
温度与放电时序的关系：使用原代皮质大鼠神经元，在35.5-37°C范围内以250毫开尔文的步阶变化培养温度。通过分析放电时间触发的光栅图（STTRP），研究人员发现，随着温度升高，特定神经通路上动作电位的传导延迟（Latency）显著减小。例如，一个标记波段（3.25-4.5毫秒）的延迟中位数随温度升高而降低。同时，传输保真度（在延迟窗口内出现放电的概率）与温度的相关性因所分析的神经通路而异，有的升高，有的降低。更重要的是，延迟的变化与温度变化曲线几乎完美同步，表明这是一种直接的因果效应，而非通过神经元可塑性等间接机制产生的缓慢适应。
- 2.
蒸发与放电活动的关系：研究人员让原代神经元培养物的培养基自由蒸发约4小时（蒸发速率约0.18微升/分钟），然后重新补充液量至初始水平。结果显示，在蒸发阶段，网络的平均放电频率从约2赫兹逐渐下降至约1赫兹。即使补充液量后，放电频率也未能完全恢复至初始值。对放电模式相似性的定量分析表明，放电模式与初始稳定阶段的相似性在蒸发过程中从约0.63逐渐衰减至约0.33，补充液量后仅部分恢复至约0.45。这表明，培养基蒸发导致的渗透压变化不仅影响放电频率，还会显著改变神经网络的放电模式，且某些影响可能是长期或不可逆的。
- 3.
全自动药物测试模型实验：为展示Inkube在药物筛选方面的潜力，研究团队使用人诱导多能干细胞分化的神经元（iNeuron）进行了一项镁离子（Mg
2+）浓度影响的模型实验。系统自动将培养基中的镁离子浓度从0.81毫摩尔逐步增加到3.81毫摩尔（步阶1毫摩尔），每个浓度下给予10分钟的电刺激（4赫兹）。最后，自动执行三次50%培养基更换（用0.81毫摩尔的培养基），进行“洗脱”。整个2小时的实验无需人工干预。结果显示，随着Mg
2+浓度增加，神经元对刺激的反应性降低，放电延迟增加。洗脱后，反应性有所恢复，但未完全回到初始水平，表明神经元需要时间来适应环境变化。此实验成功模拟了剂量-反应曲线，验证了Inkube进行自动化、并行化药物筛选的可行性。
结论与展望
Inkube作为一个将培养箱、电生理记录和灌流系统深度整合的一体化开源解决方案，成功实现了对神经元培养环境的精确、并行和自动化控制。其实验明确揭示了温度波动和培养基蒸发（影响渗透压）会显著影响神经元的放电活动模式和频率，这强调了在可塑性研究、药物筛选等需要精密测量放电行为变化的实验范式中，严格控制环境变量的极端重要性。
该系统的优势在于其开源、模块化、可扩展和高通量（最多4个MEA并行）的特性。它不仅可用于本研究展示的原代神经元和iNeuron，也适用于脑切片、类器官等其他模型。未来，通过集成光学成像（如钙成像）、光遗传学刺激、或其他气体传感器（如氧传感器），Inkube的功能可进一步扩展。结合机器学习实现智能闭环环境调控或刺激，将为其在探索神经系统功能与疾病机制方面开辟更广阔的应用前景。尽管实验设置存在一定耗时，但其高度自主性使其在需要长期、稳定记录的大型筛选实验中极具吸引力。
