《Advanced Sensor Research》：Label-Free Detection of PSA Using Laser-Induced Graphene/ZnO Nanorod-Based Impedimetric Immunosensors
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本研究首次报道了一种基于激光诱导石墨烯/氧化锌纳米棒复合电极的无标记阻抗型免疫传感器，用于前列腺特异性抗原的高灵敏度检测。该传感器利用氧化锌的高等电点特性，通过简单的抗体物理吸附策略，实现了在临床相关浓度范围内的PSA检测，其检测限低至81皮克/毫升。与常规阻抗型免疫传感器“信号增强”的行为模式相反，该传感器展现出独特的“信号减弱”行为，即PSA结合后电荷转移电阻反而降低。这一反直觉现象揭示了传感材料独特性质及其生物功能化过程对传感器性能的关键影响，为设计低成本、适用于资源有限地区的前列腺癌即时诊断设备提供了新的思路。
前列腺癌是全球男性中最常见的癌症之一，其早期检测对于改善预后至关重要。前列腺特异性抗原作为一种关键的糖蛋白生物标志物，其血清水平的升高与前列腺癌的发展密切相关。然而，目前主流的PSA检测方法，如酶联免疫吸附测定，通常在中心化实验室进行，存在耗时、成本高且难以即时应用的局限。因此，开发适用于即时诊断的小型化、快速且低成本的新型生物传感平台具有迫切需求。
近年来，电化学生物传感器因其操作简单、易于小型化和成本效益高等优点，在即时诊断领域受到广泛关注。其中，基于石墨烯的材料因其优异的电学性能和大的比表面积展现出巨大潜力。激光诱导石墨烯作为一种新兴的三维多孔石墨烯材料，可通过激光直写技术在各种芳香族聚合物基底上原位合成，其结构由相互连接的多层石墨烯薄片构成，形成了层次化的多孔结构。这种结构缺陷丰富、边缘密度高，为电化学传感提供了大量的活性位点。然而，LIG粗糙多孔的表面形貌和化学性质为其生物功能化带来挑战。氧化锌作为一种宽带隙半导体，具有高等电点（约pH 9-9.5）和良好的生物相容性，是修饰LIG的理想材料。将ZnO纳米棒与LIG复合，既能利用ZnO的高等电点促进生物分子（如抗体）的直接吸附，又能结合LIG优异的导电性和三维多孔结构，从而构建高性能的电化学传感界面。
本项研究的核心是开发并评估一种基于LIG/ZnO纳米棒复合材料的无标记阻抗型免疫传感器，用于PSA的检测。研究人员首先在聚酰亚胺基底上利用CO2激光诱导生成LIG，随后通过脉冲电沉积法在其表面生长ZnO纳米棒。扫描电子显微镜图像显示，所得LIG呈现三维互联的石墨烯薄片网络结构，具有丰富的微孔和宏观孔隙；电沉积的ZnO纳米棒则在LIG表面形成高密度的、结晶良好的晶体。拉曼光谱和X射线衍射谱进一步证实了LIG的石墨烯特性以及ZnO纳米棒的纤锌矿晶体结构。
在传感电极的构建中，研究评估了两种抗PSA抗体的固定化策略：共价键合法和直接吸附法。共价键合法通过APTES在ZnO表面引入氨基，再利用EDC/NHS化学将抗体的Fc区共价连接；而吸附法则直接利用ZnO的高等电点与抗体在生理pH下带负电的特性，通过静电作用实现抗体的物理吸附。电化学阻抗谱跟踪了功能化过程的每一步。结果显示，无论采用哪种方法，抗体固定后电极的电荷转移电阻均显著增加，表明生物分子的修饰成功阻碍了氧化还原探针与电极表面的电荷转移。值得注意的是，共价固定导致了更大的RCT变化，暗示了更高的抗体负载量和/或不同的抗体取向。
传感器的性能测试在含有3-/4-氧化还原对的PBS缓冲液中进行。出乎意料的是，采用共价固定抗体的传感器在高达100纳克/毫升的PSA浓度范围内未表现出明显的特异性响应。相反，采用吸附法固定抗体的传感器则展现出了优异的性能。在PSA浓度从0.1增加到10纳克/毫升的临床相关范围内，传感器的RCT值随PSA浓度升高而持续降低，呈现出一种“信号减弱”的响应模式。该传感器的检测限经计算为81皮克/毫升，并在10纳克/毫升左右达到饱和。特异性实验表明，传感器对人绒毛膜促性腺激素无响应，显示出良好的特异性。
这种“信号减弱”行为与传统阻抗免疫传感器的常规认知（即抗原结合增加空间位阻和介电屏障，导致RCT增加）截然相反。为了解释这一反直觉现象，研究人员提出了几种可能的机制。其一，PSA与抗体的特异性结合可能引起抗体构象或取向的改变，从而减少了其对电荷转移的阻碍。其二，免疫复合物的形成可能降低了其与ZnO表面的亲和力，导致部分复合物从电极表面解吸附，从而暴露出更多的ZnO活性位点，促进了氧化还原探针的电荷转移。X射线光电子能谱分析为解吸附假说提供了一定支持。对比暴露于高浓度PSA溶液前后的传感器表面元素组成，发现蛋白质酰胺信号和N/Zn原子比显著下降，表明有相当数量的蛋白质从表面移除。其三，免疫复合物形成引起的表面电荷分布变化，可能调制了n型ZnO半导体近表面耗尽层的宽度，从而影响了多数载流子的浓度，进而改变了与氧化还原探针的电荷转移效率。这些机制可能协同作用，导致了观察到的RCT降低。
本工作首次将LIG/ZnO纳米棒复合材料成功应用于PSA的阻抗免疫传感。研究表明，利用ZnO的高等电点进行抗体物理吸附是一种简单有效的功能化策略，能够实现临床相关浓度范围内PSA的高灵敏度、高特异性检测。更重要的是，该传感器表现出的独特“信号减弱”行为，挑战了传统阻抗传感模型，强调了在设计新型免疫传感器时必须充分考虑换能材料及其生物功能化过程的独特物理化学性质。这项工作不仅为前列腺癌的早期、低成本即时诊断提供了一种有前景的传感平台，也为理解和设计基于半导体纳米复合材料的下一代生物传感器提供了新的物理见解。未来的研究可在更复杂的生物基质（如血清）中验证传感器性能，并进一步深入探究其独特的传感机制。
