《Interdisciplinary Medicine》：Holistic bone developing microenvironment engineered apoptotic extracellular vesicles recapitulate multidimensional developmental signatures in adult and senile bone repair
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本综述提出了一种创新的全景微环境工程化凋亡细胞外囊泡（hME-ApoEVs）策略，以突破传统单因子工程（ME-ApoEVs）的局限。通过体外模拟由M2a样巨噬细胞驱动的骨发育免疫微环境，成功制备出hME-ApoEVs。研究表明，这些工程化囊泡能够继承并传递“骨与软骨发育”、“其他组织发育”、“间充质凝聚”和“环境信号”等多维发育特征，并通过激活Wnt/β-catenin信号通路，在骨髓间充质干细胞（BMSCs）及成年/衰老动物颅骨缺损模型中有效重现发育性骨再生，为再生医学提供了强有力的新型治疗工具。
引言：超越单因子工程的再生新策略
凋亡细胞外囊泡（ApoEVs）因其继承了亲本细胞丰富的生物活性物质，已成为再生医学中强大的生物制剂。为了增强ApoEVs的再生效力，研究者提出了微环境工程化ApoEVs（ME-ApoEVs）的策略。然而，传统的ME-ApoEVs策略主要聚焦于在囊泡中嵌入单一的微环境因子。由于微环境是一个由多种因子共同调控再生的复杂系统，单一主导因子不足以重现天然微环境的复杂性。因此，本研究引入了一种新颖的全景微环境工程化ApoEVs（hME-ApoEVs）策略，旨在系统性识别并整合微环境中的组合因子，以模拟天然微环境的整体特征，从而制备出更优越的ME-ApoEVs。
为验证hME-ApoEVs的概念，研究选择骨发育微环境作为目标，旨在成年骨修复中重现发育特征。其核心工作流程包括：首先，解析目标微环境以识别其支持组织再生的关键特征；其次，确定驱动该微环境的关键细胞及其诱导再生的分子机制；接着，基于对关键细胞和目标微环境的理解，在体外培养关键细胞并通过模拟其关键特征来诱导生成目标微环境；最后，在体外模拟的微环境中，诱导干细胞释放ApoEVs，即得到所需的hME-ApoEVs。
结果与讨论
1. 解析骨发育微环境的关键特征与驱动细胞
研究首先通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和组织学分析，比较了胚胎期第15.5天大鼠的发育颅骨（Dev.组）与成年大鼠损伤后第7天的修复颅骨（Rep.组）的微环境。分析发现，发育骨微环境是一个以巨噬细胞为主的免疫微环境，巨噬细胞占比超过30%，而在修复组中，免疫细胞类型更多样，巨噬细胞占比不足30%。这提示巨噬细胞介导的免疫微环境是区分骨发育与修复微环境的关键。
基因功能和通路分析表明，发育组巨噬细胞与间充质干细胞（MSCs）的基因表达高度相关，这些相关基因在MSCs中显著富集于“其他组织发育”、“间充质凝聚”、“骨与软骨发育”等生物过程，并表现出Wnt信号通路和细胞凋亡相关通路的簇状激活模式。组织学检查进一步验证了发育微环境的关键特征：在发育组可见 destined to become bone区域的间充质凝聚形成骨基质、正在发育的骨髓腔和包含大量未成熟细胞的颅缝；而修复组在损伤后7天，缺损中心主要由疏松的纤维结缔组织填充。这些比较分析共同描绘了骨发育微环境的标志性特征：以巨噬细胞为主导的免疫景观，以及包含活跃的组织形态发生和特定信号通路（如Wnt）在内的多维发育特征。
进一步对发育组巨噬细胞进行表型分析，通过数据非依赖性采集（DIA）蛋白质组学和免疫组化验证，发现其高表达M2a亚型特异性标志物，如TGF-β、TREM2和甘露糖受体C型1（MRC1）。因此，研究确定M2a样巨噬细胞是驱动骨发育微环境中多维发育特征的关键细胞。
2. 骨发育hME-ApoEVs的制备及其对发育特征的继承验证
基于上述发现，研究通过在体外模拟M2a样巨噬细胞驱动的免疫微环境来制备hME-ApoEVs。具体方法是用白细胞介素-4（IL-4）刺激巨噬细胞使其极化为M2a表型，收集其条件培养基作为模拟的发育免疫微环境。将大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）在此模拟微环境中培养后，用十字孢碱（STS）诱导其凋亡，并通过差速离心分离ApoEVs，即得到hME-ApoEVs（hME组）。对照组（Con组）则为未经任何处理的BMSCs直接诱导凋亡产生的ApoEVs（Con-ApoEVs）。
对hME-ApoEVs和Con-ApoEVs的表征显示，两者均具有典型的80-120 nm直径、双层膜结构，并富含CD63、CD9、TSG101等EV标志蛋白以及cleaved caspases-3/4/7/8/9等凋亡相关蛋白。DIA蛋白质组学分析比较发现，与Con-ApoEVs相比，hME-ApoEVs中显著富集了多维发育特征相关的蛋白，包括“骨与软骨发育”、“其他组织发育”、“间充质凝聚”和“环境信号”。其中，Wnt信号通路被鉴定为最主要的环境信号通路。基因集富集分析（GSEA）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析均证实了hME-ApoEVs中Wnt信号通路在通路水平上的激活。免疫荧光验证也显示，hME-ApoEVs中保留了Wnt/β-catenin通路的关键组分糖原合成酶激酶3β（GSK3β）。这些结果证明，hME-ApoEVs成功继承了骨发育微环境的四个关键发育事件特征。
3. hME-ApoEVs在BMSCs中重现多维发育特征的效力评估及机制揭示
接下来，研究探究了hME-ApoEVs是否能够将这些发育特征传递给成年BMSCs。免疫荧光证实两种ApoEVs均能被成年BMSCs有效内化。对经hME-ApoEVs（ME组）或Con-ApoEVs（Con组）处理的BMSCs进行RNA测序发现，hME-ApoEVs的刺激能诱导成年BMSCs重现四个发育事件的特征，即“其他组织发育”、“间充质凝聚”、“骨与软骨发育”和“环境信号”相关基因显著上调。GO富集分析和GSEA均确认了hME-ApoEVs处理的细胞中Wnt信号通路被激活。定量PCR验证了Wnt通路关键基因（Wnt5b, Wnt2等）、骨与软骨发育相关基因（Bglap, Bmp4等）以及骨再生相关分子（Mmp13, Col3a1等）的表达上调。功能实验也表明，hME-ApoEVs处理能显著增强BMSCs的增殖能力和早期成骨活性。
为阐明hME-ApoEVs重编程成年BMSCs的分子机制，研究对RNA-seq数据进行了蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。结果显示，在hME-ApoEVs处理的BMSCs中上调最显著的500个基因里，有38%与hME-ApoEVs所携带的Wnt通路组分存在功能连接。共富集分析揭示了这些上调基因与关键发育特征（包括三个发育事件和细胞凋亡）之间的强关联，并将Wnt组分确定为发育重编程的核心介质。KEGG通路图谱进一步确认了hME-ApoEVs处理后BMSCs中Wnt/β-catenin通路的激活，涉及上游调节因子、核心组分和下游效应器。hME-ApoEVs中的Wnt信号相关基因与BMSCs中的表达呈正相关。使用Wnt通路抑制剂IWR-1进行功能验证，发现其可废除hME-ApoEVs诱导的发育事件，使Bglap和Bmp4等基因表达恢复至基线水平。这些结果确证，hME-ApoEVs很可能是通过传递并激活Wnt/β-catenin通路，从而使成年BMSCs重现发育能力。
4. hME-ApoEVs在成年及衰老骨修复模型中重现多维发育特征的验证
最后，研究在成年大鼠和老年小鼠的颅骨临界尺寸缺损模型中评估了hME-ApoEVs的体内再生潜力。
在成年大鼠模型中，显微CT定量显示，与Con-ApoEVs治疗组（Rep.+Con）相比，hME-ApoEVs治疗组（Rep.+hME）在术后4周表现出显著改善的骨微结构参数，包括骨小梁表面积（Tb.BS）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨体积分数（Tb.BV/TV）。组织学检查也显示hME-ApoEVs组有加速、增厚的骨形成和成熟的骨小梁网络。
对治疗后7天的缺损组织进行scRNA-seq分析发现，与未治疗对照组相比，hME-ApoEVs治疗组的细胞动态存在明显差异。GO富集分析显示，治疗组BMSCs中重现了“其他组织发育”、“间充质凝聚”和“骨与软骨发育”这三个发育特征，并且Wnt信号通路被激活。KEGG通路分析也强调了hME-ApoEVs组中Wnt信号通路基因的上调。免疫组化染色进一步证实，间充质凝聚的关键标志物E-钙粘蛋白和纤连蛋白1（FN-1）在hME-ApoEVs组中表达显著上调。同时，β-catenin的免疫组化染色以及CD105（MSC标志物）与β-catenin的双重免疫荧光标记显示，hME-ApoEVs组的MSCs中β-catenin核转位增加，证实了Wnt/β-catenin通路的激活。FN1与GSK-3β的双重免疫荧光也表明，hME-ApoEVs处理的缺损中，表达FN1的MSCs内GSK-3β水平显著升高，说明Wnt信号在再生微环境内的MSCs中被特异性激活。
在老年小鼠的颅骨缺损模型中，虽然样本量有限，但显微CT和组织学的定性观察显示，与对照组相比，hME-ApoEVs治疗组有骨微结构改善和更成熟骨小梁形成的趋势。免疫组化分析也提示hME-ApoEVs组中骨钙素（OCN）、CD31和FN1的表达可能有所增加，表明即使在衰老的微环境中，hME-ApoEVs也可能促进类似发育的再生模式。
全景微环境工程策略对先进ApoEVs的启示与结论
本研究成功构建了骨发育hME-ApoEVs，并在囊泡自身、靶细胞和动物模型三个层面有效重现了骨发育微环境的关键特征。该策略首先将骨发育微环境解析为由M2a样巨噬细胞驱动的、具有多维发育特征的免疫微环境；进而通过在体外诱导关键细胞M2a样巨噬细胞来模拟该微环境，并制备出hME-ApoEVs；最终证实hME-ApoEVs能够通过激活Wnt/β-catenin信号通路，在BMSCs及成年/衰老骨缺损模型中重现多维发育特征，促进骨再生。
这种基于自然生物医学原理的全景微环境工程策略，通过模仿微环境调控下ApoEVs的生理性产生过程，制备出的hME-ApoEVs作为单一载体，显示出传递复杂微环境信号的卓越潜力。相比于干细胞疗法，hME-ApoEVs具有更少的伦理和生物安全性担忧，以及更大的临床灵活性。这项研究为再生医学，特别是针对复杂缺损的治疗，提供了一种创新且实用的先进ApoEVs工程策略，具有广阔的临床应用前景。
