《Advanced Science》：Developmentally Inspired, Mechanical–Metabolic Dual Gradient Osteochondral Constructs Bridging Regeneration and Therapeutic Screening
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本研究提出了一种受发育启发的3D打印骨软骨（OC）构建体，其整合了力学（刚度）和代谢（孔隙率/渗透性）双重梯度，可在无需外源生长因子的情况下，精准引导人骨髓间充质干细胞（hMSCs）成球体进行空间特异性分化（软骨形成与成骨）。该构建体不仅成功修复了大鼠骨软骨缺损，还能作为病理生理学相关的骨关节炎（OA）模型，用于评估药物（如地塞米松、雷帕霉素、塞来昔布）在软骨和骨组织中的特异性响应，为再生医学与临床前治疗筛选提供了一个创新的多功能平台。
优化hMSC成球体形成以维持干细胞特性
人间充质干细胞（hMSCs）因其多向分化潜能成为本研究的关键细胞来源。为避免单细胞悬液植入后的细胞丢失和干细胞特性丧失，研究采用微孔板培养系统生成了均匀、大小可控的hMSC成球体。通过比较不同接种密度（100、200、500细胞/微孔），发现500细胞/微孔培养4天的条件在形态均匀性和干细胞标志物（Stro-1, Endoglin）表达上表现最优，能有效模拟发育的凝聚阶段，增强细胞间相互作用并维持干细胞特性。与封装在凝胶中的单细胞相比，成球体培养能更显著地上调干细胞及相关临床标志物（如CD90, CD146, CD106）的表达，这有利于移植细胞的稳定、归巢和免疫调节。
GelMA-海藻酸生物墨水/PCL支架的力学与流变学性能
为提供引导细胞分化的力学线索，研究选用了甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和离子交联的海藻酸（Alginate）制备了复合生物墨水。通过调节GelMA浓度（5%和10%）和海藻酸的添加，获得了具有不同压缩模量的“软骨源性”软墨水（G5A1，~10 kPa）和“成骨源性”硬墨水（G10A1，~30 kPa）。流变学测试证实了墨水的剪切稀化行为、应力松弛特性以及良好的结构稳定性。为确保构建体的机械强度并创建代谢梯度，采用了混合打印策略，将细胞负载的水凝胶与聚己内酯（PCL）框架共打印。PCL框架被设计为具有梯度变化的孔径（900, 700, 500, 300 μm），从而在构建体内形成从高渗透性（骨侧）到低渗透性（软骨侧）的代谢梯度。全厚度构建体的压缩模量落在天然骨软骨组织的范围内，有利于减少机械不匹配和炎症反应。
刚度与孔隙率对空间程序化分化的协同效应
研究验证了微环境刚度和孔隙率如何协同引导hMSC成球体的定向分化。免疫荧光染色显示，在硬的G10A1水凝胶中，成骨关键转录因子RUNX2和细胞外基质蛋白COL I表达显著上调，且YAP蛋白主要定位于细胞核，表明硬基质通过力学转导促进成骨。相反，在软的G5A1水凝胶中，软骨形成主调控因子SOX9和COL II的表达更高，YAP则更多停留在胞浆。进一步地，在固定刚度条件下，改变PCL支架的孔隙率也能调控细胞功能：在软水凝胶中，较小的孔隙（300-500 μm）更有利于糖胺聚糖（GAG）的沉积（通过阿尔新蓝染色证实），模拟了软骨的缺氧、营养受限环境；而在硬水凝胶中，较大的孔隙（700-900 μm）则促进了钙沉积（通过茜素红S染色证实），有利于成骨和矿化。定量分析表明，刚度与孔隙度梯度的整合产生了协同效应，能实现单一刺激系统无法达到的空间分辨分化效果，从而在单个构建体内模拟出从软骨到骨的连续过渡结构。
用于功能性骨软骨再生的血管生成与代谢梯度
成功的骨软骨再生需要模拟天然的血管和营养梯度。研究表明，随着支架孔隙率的增大，内皮细胞的成管能力（通过成管实验评估）逐渐增强，血管网络指标（连接点、网孔数、总长度）呈梯度上升。这意味着在设计的构建体中，高孔隙率的“骨层”区域更易于血管化，而低孔隙率的“软骨层”则维持了相对缺氧的环境。细胞因子阵列分析进一步证实了这种空间异质性：在成骨层区域，促血管生成细胞因子（如ApoA2, GH）表达较高；而在软骨层区域，缺氧相关细胞因子（如CSF3, uPAR）更为富集。这种对血管和代谢梯度的精确控制，增强了构建体的生理相关性，对实现长期稳定的组织整合至关重要。
作为临床前药物筛选平台的阶段特异性骨软骨骨关节炎模型
该研究的一大优势是将构建体拓展为体外骨关节炎（OA）模型。通过用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）处理已成熟的构建体，成功诱发了OA样病理状态。模型再现了软骨和骨组织的阶段特异性响应：软骨相表现出细胞活性下降、糖胺聚糖（sGAG）含量快速丢失；骨相则先出现碱性磷酸酶（ALP）活性短暂升高（对应早期异常骨改建），随后下降。利用此模型，研究人员测试了地塞米松、雷帕霉素和塞来昔布三种不同作用机制药物的疗效。结果显示，药物反应具有组织特异性：在软骨相，三种药物均能部分恢复sGAG含量；而在骨相，仅地塞米松能显著提升ALP活性，这与其广泛抑制上游炎症通路并直接促进成骨分化的作用相符。细胞因子谱分析也证实，药物治疗能使OA诱导的构建体向抗炎状态转变。此模型能够同时评估软骨和骨的结局，为临床前OA药物筛选提供了更生理相关的平台。
基于体内骨软骨缺损模型的生物相容性与治疗效果评估
通过大鼠皮下植入和股骨滑车沟骨软骨缺损模型，评估了构建体的生物相容性和再生能力。皮下植入实验表明，材料（PCL、GelMA-海藻酸水凝胶）及负载的细胞均未引起显著的局部或全身毒性反应。在骨软骨缺损修复实验中，植入12周后，仅含刚度梯度或仅含孔隙率梯度的构建体修复效果有限，而同时具备力学和代谢双重梯度的构建体（双梯度组）表现出最佳的修复效果：缺损表面被新生组织覆盖，与宿主组织整合良好，微计算机断层扫描（micro-CT）定量分析显示其骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量等参数显著优于损伤对照组。组织学分析进一步证实，双梯度构建体促进了软骨和骨组织的再生与整合。
结论
本研究成功开发了一种受发育启发的、多材料3D打印骨软骨构建体。它通过整合刚度梯度和孔隙率/代谢梯度，在无需外源生化因子补充的情况下，有效引导了hMSC成球体的空间特异性分化，实现了软骨和骨组织的同步再生。该构建体不仅在大动物模型中展现了良好的修复效果，还能作为一个保留软骨-骨交互对话的病理生理相关性骨关节炎模型，用于阶段特异性药物筛选。这项工作为骨软骨缺损的再生治疗和骨关节炎的药物开发提供了一个集成的、多功能的先进平台。
