《Journal of Genetics and Genomics》：Engineering Tregs-mediated immune tolerance via
foxp3a overexpression to evade allograft transplantation barriers in zebrafish
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推荐：为解决斑马鱼中同种异体性腺移植的免疫排斥问题，研究人员开展了利用foxp3a过表达诱导调节性T细胞（Tregs）介导免疫耐受的研究。结果表明，构建的Tg(CMV:foxp3a)斑马鱼表现出Tregs样免疫抑制表型，能显著加速皮下性腺原基移植（SGPT）和腹腔内生殖干细胞移植（IGCT）后生殖细胞的成熟，为鱼类基因组操作和移植提供了实用化的免疫耐受宿主新策略。
器官移植是治疗多种终末期疾病的重要手段，然而，免疫排斥反应始终是移植成功路上的一大“拦路虎”。在哺乳动物中，调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）是维持免疫耐受、抑制排斥反应的关键角色。人们不禁联想，能否借鉴这一策略，在其他模式生物中也“训练”出免疫系统，让它对外来移植物“网开一面”呢？斑马鱼作为一种重要的脊椎动物模型，在发育生物学和疾病研究中应用广泛，其基因编辑和细胞移植技术也日趋成熟。但在斑马鱼中进行同种异体组织或细胞移植，尤其是性腺相关移植以加速转基因品系构建时，同样面临着宿主免疫系统攻击移植物的问题。现有的解决方案，如使用免疫缺陷型斑马鱼或长期施用免疫抑制剂，都存在宿主易感染、生存率低、副作用大等显著缺陷。那么，能否在斑马鱼体内，也“培植”一支Tregs“维和部队”，在不严重削弱整体免疫力的前提下，特异性诱导对移植物的耐受呢？这正是发表在《Journal of Genetics and Genomics》上的这项研究试图回答的核心问题。
为了探索这一可能性，研究人员将目光投向了Tregs的“司令官”——转录因子Foxp3。在哺乳动物中，Foxp3是Tregs谱系发育和功能维持的主调控因子。斑马鱼中存在Foxp3的同源基因foxp3a，且已有研究表明其在Tregs功能中扮演关键角色。由此，研究团队提出了一个大胆的设想：通过系统性过表达foxp3a，是否能在斑马鱼体内诱导产生具有免疫抑制功能的Tregs，从而创造出一种具有免疫耐受特性的新型移植宿主？
研究人员综合利用了转基因技术、单细胞转录组测序（scRNA-seq）、RNA-seq、原位杂交、免疫荧光染色等多种关键技术方法。他们以Casper透明品系斑马鱼为背景，构建了全身性过表达foxp3a的转基因斑马鱼品系Tg(CMV:foxp3a)。利用来自Tg(ddx4:EGFP)转基因鱼的生殖细胞或性腺原基作为移植物，分别在野生型和转基因宿主中进行了腹腔内生殖干细胞移植（IGCT）和皮下性腺原基移植（SGPT），并通过转录组学和单细胞测序深入分析了宿主免疫状态和移植后的免疫动态。所有动物实验均遵循中国科学院相关委员会的指导原则进行。
结果
1. 构建并免疫学表征foxp3a全身性过表达转基因斑马鱼
研究成功构建了Tg(CMV:foxp3a)转基因斑马鱼品系。免疫学分析显示，与野生型相比，转基因鱼在头肾和胸腺中foxp3a阳性细胞比例增加，同时Tregs负调控因子cd127表达下调，而多个免疫抑制因子（如tnfrsf9a, tnfrsf18）表达上调。胸腺转录组分析发现，T细胞受体、共刺激分子、细胞因子等相关基因表达显著下调，提示T细胞功能处于“失能”或静息状态。重要的是，Tg(CMV:foxp3a)鱼在标准养殖条件下存活率与野生型相当，远高于il2rga?/?免疫缺陷突变体，表明其具有良好的生存能力。
2. 单细胞RNA测序分析揭示Tg(CMV:foxp3a)外周免疫谱系重塑
对3月龄斑马鱼头肾进行scRNA-seq分析发现，与野生型相比，Tg(CMV:foxp3a)鱼头肾中T细胞和B细胞整体比例下降。进一步亚群分析显示，效应T细胞（如CD8+初始T细胞、IFNγ+效应T细胞）比例显著减少，而静息T细胞和先天样T细胞比例增加。这些静息T细胞高表达静息Tregs标志物ccr7，并表现出Tregs样特征。在B细胞中，效应性和促炎性B细胞亚群减少，而调节性B细胞（Bregs）在效应B细胞中的比例显著升高。这表明foxp3a过表达重塑了免疫细胞组成，使其向耐受状态倾斜。
3. 同种异体性腺组织可在Tg(CMV:foxp3a)皮下定植并增殖
将来自4天受精后（dpf）Tg(ddx4:EGFP)供体鱼的性腺原基移植到60 dpf的宿主鱼皮下。在野生型宿主中，移植物在7-14天内被迅速排斥清除。而在Tg(CMV:foxp3a)宿主中，约25%的个体在移植后35天（dpt）形成了明显增生的移植物，其中含有大量EGFP阳性的生殖细胞，表明移植物成功定植并增殖。
4. 通过SGPT加速产生供体来源的功能性转基因精子
对移植后35天的移植物进行分析发现，其中的生殖细胞加速成熟，包含了从精原细胞到成熟精子（SPZ）的各阶段细胞，其发育状态等同于95 dpf的野生型成熟睾丸，而相同日龄（39 dpf）的供体对照睾丸中尚未形成精子细胞。从移植物中释放出的精子形态正常，并能使野生型卵子受精，产生正常发育且表达EGFP的胚胎，证实了其功能性。
5. 皮下移植后移植物和宿主胸腺的免疫动力学
RNA-seq分析移植后10天和14天的移植物和宿主胸腺。发现在移植后10天，Tg(CMV:foxp3a)宿主胸腺和移植物中MHC I类分子（mhc1uba, mhc1uka）表达量高于野生型对照，同时foxp3a表达上调，表明免疫系统处于一种“既激活又被抑制”的平衡状态。到移植后14天，成功定植的宿主胸腺转录组显示抗原呈递和免疫激活信号减弱，而免疫调节基因（如il22, il26）表达上调，表明免疫状态向抑制和耐受方向转变，有利于移植物存活。
6. 生殖干细胞（GSCs）可在Tg(CMV:foxp3a)腹腔内定植并快速增殖
将经Percoll密度梯度离心纯化的、来自3月龄供体睾丸的GSCs，通过泄殖腔微注射移植到2月龄的Tg(CMV:foxp3a)宿主腹腔内。移植后35天，在部分转基因宿主腹腔内和睾丸中可检测到供体来源的EGFP阳性生殖细胞，其睾丸组织包含正常的生精细胞谱系，并能产生有功能的精子，与野生型雌鱼自然交配后能产生转基因后代。
结论与讨论
本研究成功通过系统性过表达foxp3a，在斑马鱼中建立了一种基于诱导Tregs的免疫耐受策略。构建的Tg(CMV:foxp3a)转基因鱼表现出独特的免疫耐受微环境：T细胞和B细胞的效应功能受到抑制，静息态和调节性细胞亚群扩增。这种状态并非全面的免疫缺陷，而是主动调节下的免疫平衡，因此转基因鱼在常规条件下保持了与野生型相当的存活率。
更重要的是，该研究证实了这种免疫耐受斑马鱼作为移植宿主的巨大潜力。无论是皮下性腺原基移植（SGPT）还是腹腔内生殖干细胞移植（IGCT），Tg(CMV:foxp3a)宿主都能显著支持同种异体生殖组织的定植、存活和加速成熟，在较短时间内获得有功能的供体来源配子。这为解决斑马鱼基因编辑和转基因技术中生殖系传递效率低、耗时长的瓶颈问题，提供了一个强大而实用的新平台。与传统的免疫缺陷模型相比，此模型避免了宿主易感性高、难以饲养的缺点；与免疫抑制剂相比，则避免了全身性毒副作用。
该研究不仅为鱼类生殖生物技术和遗传操作提供了革新性的工具，也为了解Tregs介导的免疫耐受在脊椎动物中的进化保守性和调控机制提供了新的见解。尽管目前foxp3a是全身性过表达，且移植成功率仍有提升空间，但这项工作为未来开发更精准、高效的免疫耐受诱导策略（如细胞类型特异性表达、联合诱导Bregs等其他调节性免疫细胞）奠定了坚实基础，在移植生物学、生殖工程和基因编辑等领域具有广泛的应用前景。
