《Journal of Lipid Research》：Total oxylipin concentrations in NIST SRM 1950 plasma compared to fresh and commercial obtained human plasma
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本研究针对氧化脂质（Oxylipins）分析缺乏标准参考物与基线浓度范围的问题，通过应用经国际验证的标准操作程序，系统测定了NIST SRM 1950标准人血浆及新鲜制备血浆中总氧化脂质的浓度。结果表明，NIST血浆与新鲜血浆的氧化脂质水平相近，为健康人血浆氧化脂质的预期浓度范围提供了关键参考数据。此研究证实NIST SRM 1950可作为氧化脂质分析质量控制的有效标准品，并揭示了不当存储会导致血浆中氧化脂质水平被人为夸大（可高达100-1000倍），强调了规范样品处理的重要性。
在我们的血液中，有一类被称为氧化脂质（Oxylipins）的分子家族，它们是多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFA）经过氧化代谢后的产物，包括羟基化多不饱和脂肪酸（hydroxy-PUFA）和环氧基多不饱和脂肪酸（epoxy-PUFA）。这些微小的脂质信号分子扮演着重要的生物信使角色，参与调控炎症、血管功能等多种生理和病理过程。因此，准确测量它们在人体，尤其是在血浆中的浓度，对于理解疾病机制、评估营养干预效果乃至开发新的生物标志物都至关重要。
然而，精确测量氧化脂质绝非易事。在血浆中，绝大多数氧化脂质并非以“自由”形式存在，而是被酯化在磷脂等复杂脂质分子中。要测定它们的“总量”，需要进行复杂的化学处理（如碱水解）将它们释放出来，再利用高灵敏度的液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）进行分析。整个流程，从样品采集、存储、前处理到仪器分析，任何一个环节的疏漏都可能导致氧化脂质的降解，更糟糕的是，引发脂质的非酶促“自氧化”（autoxidation），产生大量非生理性的氧化产物，使测量结果严重失真。长期以来，研究人员面临一个困境：不同实验室报告的血浆氧化脂质浓度差异巨大，我们无法确定，在健康人体内，这些分子的正常浓度范围究竟是多少？此外，市场上虽有商业化的标准血浆或血浆池用于质量控制，但其来源和处理历史不明，其氧化脂质水平是否可靠，也一直是个问号。
为了回答这些问题，并为整个研究领域建立一个可靠的“标尺”，由Nadja Kampschulte、Nils Helge Schebb等人领导的研究团队，将目光投向了美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology, NIST）发布的SRM 1950标准物质——“冷冻人血浆中的代谢物”。这款标准物质被广泛用于代谢组学研究的质量控制和标准化。本研究的核心目的，就是利用一个已经过国际实验室间比对验证的标准操作程序（Standard Operation Procedure, SOP），精确测定NIST SRM 1950血浆中总氧化脂质的浓度，并将其与严格按照规范制备的新鲜人血浆，以及来源未知的商业血浆进行比较，从而回答：NIST SRM 1950能否作为氧化脂质分析的有效参考物？健康人血浆中氧化脂质的预期浓度范围是多少？不当的样品处理究竟会带来多大误差？这项研究成果最终发表在了脂质研究领域的权威期刊《Journal of Lipid Research》上。
为了开展这项研究，作者主要运用了几个关键技术方法：首先，研究的核心是经国际验证的氧化脂质分析标准操作程序（SOP），该方法基于碱水解（皂化）结合固相萃取的前处理步骤，以释放和纯化酯化的氧化脂质。其次，对所有样品（包括NIST SRM 1950血浆、新鲜制备的健康人EDTA血浆以及市售血浆池）的检测均依赖于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS） 技术，在负离子电喷雾电离模式下，使用多反应监测（MRM）进行高特异性、高灵敏度的定量分析。最后，为了确保结果的可靠性，研究还引入了方法学验证，即在两个独立实验室使用相同的水解协议但略有不同的样品制备策略对NIST血浆进行分析，以评估方法的一致性和数据的稳健性。
研究结果
NIST SRM 1950血浆中总氧化脂素的浓度谱
研究人员分析了146种氧化脂质，其中74种在NIST SRM 1950血浆中被成功定量。结果显示，不同类型氧化脂质的浓度差异显著。来源于长链PUFA如花生四烯酸（Arachidonic Acid, ARA）、二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid, DHA）和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic Acid, EPA）的羟基-PUFA浓度在1至75 nmol/L之间，而来源于亚油酸（Linoleic Acid, LA）的羟基-PUFA浓度可高达400 nmol/L。环氧-PUFA的浓度范围则有所不同：ARA、DHA和EPA来源的在2-20 nmol/L之间，而LA来源的环氧十八碳烯酸（EpOME）则高达70-100 nmol/L。值得注意的是，包括大多数 specialized pro-resolving mediators (SPM，如消退素、保护素、maresins等，除10,17-DiHDHA外) 和绝大多数异前列腺素（isoprostanes）在内的70种氧化脂质无法被检测到（浓度低于约0.5 nmol/L）。常见的氧化应激标志物——异前列腺素，其浓度大多低于定量下限，仅5-F2t-IsoP能被检测到，浓度约为1 nM。含有β-羟基-酮结构的 prostaglandins 和 thromboxane 在碱性条件下不稳定，因此无法通过本方法准确定量。
与新鲜制备血浆的对比
尽管NIST SRM 1950血浆经历了储存和可能的冻融循环，但其检测到的氧化脂质种类和浓度与在实验室严格条件下新鲜制备并立即冻存的健康人EDTA血浆高度一致。两者浓度大多处于同一数量级。具体而言，NIST血浆中羟基-PUFA的水平略高，而环氧-PUFA的水平略低，但二羟基-PUFA的浓度则惊人地相似。这一比较结果表明，妥善保存的NIST标准血浆能够很好地代表新鲜健康人血浆的氧化脂质谱。
与商业血浆的对比及自氧化的影响
研究揭示了一个关键问题：在来源和储存条件未知的市售人血浆池（如Cayman MaxSpec? Reference Plasma）中，检测到的羟基-PUFA和环氧-PUFA浓度极高，可达NIST SRM 1950或新鲜血浆中浓度的100至1000倍。这种异常高的浓度并非真实的生理水平，而是由于血浆在制备或储存过程中（例如未持续保存在-80°C，甚至在非冷冻状态下运输）发生了脂质的自氧化，从而人为地、大量地产生了氧化脂质。这凸显了样品处理规范对获得真实生物学数据的极端重要性。
独立实验室验证
由另一个实验室使用相同水解协议但不同样品制备方法对NIST血浆进行的独立分析，得到了与主要实验室高度一致的结果（大多数氧化脂质浓度的差异在100% ± 60%以内）。这进一步证实了所用SOP的稳健性以及NIST SRM 1950血浆数据作为参考值的可靠性。
研究结论与意义
本研究系统地测定了NIST SRM 1950标准人血浆中总氧化脂质的浓度，并证实这些浓度与其他严格控制条件下获得的新鲜健康人血浆数据高度一致。这项工作首次为健康、正常血脂的禁食人血浆中总氧化脂质的预期浓度范围提供了一个基于标准物质的、可重复的参考框架。研究明确指出，不同健康个体间的氧化脂质浓度存在差异（例如，富含n-3 PUFA的饮食会使DHA和EPA来源的氧化脂质升高3-4倍），但通常仍处于本研究所报告的范围之内。
更重要的是，本研究具有双重的方法学意义。首先，它确立了NIST SRM 1950作为氧化脂质分析的一种合适参考物质。其浓度数据可靠、与新鲜血浆可比，且通过了独立实验室验证，这使得全球不同实验室在进行氧化脂质研究时，可以借助该标准物质进行方法的质量控制、标准化和性能验证，从而提升不同研究间数据的可比性。其次，它尖锐地揭示了样品处理不当（特别是储存温度不达标）会通过自氧化导致氧化脂质数据严重失真。研究中发现的市售血浆池浓度异常升高（高达1000倍）的现象，为以往文献中部分研究报道的极高氧化脂质水平提供了一种可能的解释，警示研究人员必须对样品采集、处理和储存的每一个环节实施严格的标准操作程序，尤其是在大规模队列研究中。
总之，这项研究不仅为氧化脂质这一重要脂质介质家族在人体内的基础水平提供了关键的定量参考，还为整个研究领域的分析质量控制提供了宝贵的工具和明确的警示。它使得未来旨在探究氧化脂质在生理调节、疾病发展或营养干预中作用的研究，能够建立在更加坚实、可靠的数据基础之上。
