基于HS15的纳米疗法，用于通过鼻腔直接递送至大脑，以对抗中枢神经系统真菌感染

《Journal of Pharmaceutical Sciences》：HS15-based nanotherapeutics for direct nose-to-brain delivery against central nervous system fungal

鼻腔给药两性霉素B血脑屏障纳米复合载体HS15-LC降低神经毒性并提高脑内分布稳定性良好具有临床潜力

高硕 张 | 星旺 吉 | 韦 张 | 余玲 毛

沈阳药科大学药学院药剂学系，中国辽宁省沈阳市文华路103号，110016

摘要

两性霉素B（AmB）是一种广谱抗真菌药物，但由于血脑屏障（BBB）的限制以及全身给药的严重毒性，其在治疗中枢神经系统（CNS）真菌感染方面的应用受到限制。经鼻给药作为一种非侵入性策略，可能绕过血脑屏障，通过嗅觉或三叉神经途径将药物输送到大脑，从而提高脑内药物浓度并减少全身副作用。因此，本研究基于HS15、卵磷脂和胆固醇构建了一种纳米复合载体（HS15-LC），通过鼻腔给药将AmB输送到大脑，以探索AmB经鼻给药的可能性。以包封效率作为指标，筛选出了最佳的HS15-LC配方，并确定了其粒径和性能。结果表明，在装载前后粒径和性能均保持稳定。稳定性测试显示，该鼻喷雾在放置、稀释和喷药过程中具有良好的稳定性。体内释放和体外成像结果显示，该配方能够实现更长时间和更高水平的脑内分布。组织病理学分析证实，经鼻给药过程中黏膜毒性和肾毒性极低。总之，AmB经鼻给药是一种治疗CNS真菌感染的有前景的策略，兼具靶向脑部和安全性优势，为临床难治性真菌性脑膜炎的治疗提供了新的思路。

引言

隐球菌性脑膜炎（CM）是由隐球菌属真菌引起的中枢神经系统严重感染。¹隐球菌主要通过吸入孢子或酵母细胞经呼吸道侵入体内，随后通过血液传播至中枢神经系统，引发脑膜炎反应。AmB是一种广谱、高效且杀菌力强的药物，耐药率低，是治疗CM的首选药物。它主要与真菌细胞膜上的麦角甾醇结合，形成孔洞，增加膜通透性，导致钾离子、核苷酸和氨基酸等必需细胞内物质的泄漏和丢失。^{2, 3, 4, 5}它是许多危及生命的侵袭性真菌感染（尤其是隐球菌和唑类抗性感染）临床治疗的“终极武器”和“金标准”。例如，在颅内手术后等高风险患者中，高剂量脂质体两性霉素B被广泛认为是诊断侵袭性毛霉菌病或隐球菌病后最有效的初始治疗方法之一。

然而，传统的静脉注射方法难以使AmB绕过血脑屏障，难以在脑脊液（CSF）中达到有效治疗浓度。⁶即使在血脑屏障部分破坏的炎症性脑膜炎情况下，其CSF渗透率也低于5%。⁷为克服这一障碍，临床上尝试了鞘内注射，但这种方法具有创伤性、复杂性，并且容易引起严重的神经毒性（如化学性蛛网膜炎和癫痫发作），患者依从性极差。^{8, 9}此外，AmB的肾毒性、输注相关反应（寒战、高热）和电解质紊乱进一步限制了其长期使用。¹⁰如果能够提高脑内生物利用度并减少全身暴露，将为脑膜炎的治疗带来新的、安全且有效的方法。

经鼻给药途径^{11, 12, 13, 14}具有非侵入性、方便、无痛和高生物利用度的优势。这种给药方式使药物通过嗅觉区域输送到大脑，从而提高药物的生物利用度。经鼻给药途径主要分为嗅觉途径和三叉神经途径。¹⁵嗅觉受体神经元散布在支持细胞和基底细胞之间，形成嗅觉上皮。药物通过嗅觉途径中的神经元轴突，穿过筛板上的神经束，最终到达位于大脑表面的嗅球。嗅球是身体唯一与中枢神经系统直接接触的外周区域。¹⁶药物通过嗅觉上皮的跨上皮渗透也有助于经鼻给药后通过脑脊液输送到大脑。^{15, 17}

AmB的溶解度较差，传统剂型具有较高的肾毒性。为了解决这些问题，临床上已上市了相应的AmB磷脂复合物。¹⁸然而，这些复合物容易聚集且胶体稳定性较差。它们主要通过被动扩散穿过身体膜，导致生物利用度低且容易被单核吞噬细胞系统（MPS）清除。为了解决这个问题，本研究构建了基于HS15、卵磷脂和胆固醇的自组装纳米载体（AmB@HS15-LC）。该设计基于各组分的分子结构特性和协同自组装机制。卵磷脂¹⁹作为一种两亲分子，通过疏水尾链之间的范德华力和亲水头基团的水合作用形成稳定的脂质双层结构框架。胆固醇²⁰以其刚性的甾体核心结构嵌入卵磷脂双层中，通过调节膜流动性和微粘度显著增强了纳米载体的机械稳定性。HS15²¹是一种具有两亲性质的非离子表面活性剂，可与卵磷脂共同构建载体并促进黏膜吸收（图1）。其亲水PEG链在纳米粒子表面形成水合层，赋予纳米系统“隐身”特性²²，有效减少了血浆蛋白吸附和MPS的摄取²³，显著延长了其在体内的半衰期²⁴。这对于治疗脑部的深层、弥漫性全身性真菌感染至关重要，确保药物有足够的时间到达并积聚在感染病灶中。在甲醇中，AmB分子、卵磷脂、胆固醇和HS15均处于溶解状态，在分子水平上实现均匀混合。当通过旋转蒸发去除甲醇后，容器底部的AmB分子和载体材料形成干燥的、均匀的载体-药物混合物薄膜。此时，AmB分子“嵌入”在脂质分子基质中。由于AmB本身溶解度低且具有亲脂性和疏水性，它自然留在脂质双层的疏水层中，就像被“夹在”三明治中间一样。这一过程是热力学驱动的自发过程；疏水的AmB需要寻找疏水环境以降低系统能量。该三元体系通过自组装表现出显著的稳定性（PDI < 0.200）和优异的生物相容性，以及高包封效率（> 80%）。经鼻给药对鼻黏膜的损伤最小，血液尿素氮水平比传统静脉注射脂质体配方低约43%，显示出较低的肾毒性。

与传统脂质体²⁵相比，HS15-LC合成更简单，使用的原材料更易获得。HS15-LC的经鼻给药比传统脂质体的鞘内注射更易接受，且其在大脑中的生物利用度高于静脉注射脂质体。最重要的是，HS15-LC的经鼻给药表现出较低的肾毒性。这些优势支持我们进一步研究的决心。

材料

AmB购自大连美仑生物科技有限公司（中国大连），卵磷脂购自上海麦克莱恩生物科技有限公司（中国四川），PBS购自武汉赛维尔生物科技有限公司（中国武汉），其他试剂购自山东宇旺试剂有限公司（中国山东）。

动物

健康的雄性昆明小鼠（8周龄，28-30克）、Sprague Dawley大鼠（8周龄，200-220克）和蟾蜍购自辽宁长盛

表征

由于AmB的溶解度极低，使用HS15来提高其溶解度并提供载体材料。卵磷脂作为一种两亲表面活性剂，具有良好的两亲性、稳定性和低溶血性。基于其优异的性能，本研究探讨了使用卵磷脂和HS15与胆固醇结合通过旋转蒸发法形成复合物的可能性。

根据UV-Vis吸收光谱，AmB的最大吸收峰位于405nm（图S6）

结论

在本研究中，我们通过筛选配方成功构建了AmB@HS15-LC纳米载体系统，该系统可通过鼻腔给药有效靶向脑组织，并能有效释放以提高生物利用度。基于HS15、卵磷脂和胆固醇构建的纳米载体具有高包封效率和高安全性，表明其潜在的临床价值。在未来的研究中，我们将继续探索各种

未引用的参考文献

²¹

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。