《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Development of a self-assembling aggregation-induced emission nanoprobe for targeted therapy and real-time imaging in non-small cell lung cancer
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开发靶向c-Met的自组装AIE纳米材料AIEnp，通过MMP2响应实现肿瘤特异性聚集，兼具荧光追踪与抑制c-Met下游通路（FAK/MAPK/RAF/STAT）的疗效，体外显著抑制A549细胞活性且低毒，为NSCLC治疗提供多功能平台。
任振|李帅|崔彤|朱天杰|丁大鹏|赵京源|洪源
中国辽宁省大连理工大学附属中心医院
摘要
非小细胞肺癌（NSCLC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其预后较差，复发率较高，这主要是由于现有治疗方法的治疗效果有限且缺乏肿瘤特异性。在这项研究中，我们开发了一种新型的自组装聚集诱导发射（AIE）纳米材料（AIEnp），该材料旨在靶向c-Met，这是一种在NSCLC肿瘤进展和耐药性中起关键作用的受体酪氨酸激酶。AIEnp系统具有双重功能：它能够实现荧光追踪以实现实时成像，并提供针对c-Met的抑制作用以进行治疗干预。体外实验表明，AIEnp以浓度依赖的方式显著降低了A549肺腺癌细胞的分裂能力，同时对HEK293T体细胞几乎没有任何细胞毒性。从机制上讲，AIEnp下调了c-Met及其下游信号通路（包括FAK、MAPK、RAF和STAT），从而有效破坏了多种致癌级联反应。基于AIE的设计促进了肿瘤特异性积累和荧光追踪，解决了传统疗法中常见的肿瘤渗透性差和分布不均的问题。这些发现表明，AIEnp是一个有前景的多功能平台，可用于NSCLC的治疗，结合了靶向治疗和实时成像功能。未来的研究将集中在体内验证上，并探索AIEnps在联合疗法中的潜力，以进一步提高其临床应用性。
引言
肺癌是美国男女癌症相关死亡的主要原因。该疾病的五年生存率约为20%，2019年全球有近两百万人因此丧生，超过了所有其他癌症[1]。尽管化疗结合手术切除和放射治疗被用于治疗NSCLC的各个阶段，但预后仍然不佳，复发率高达10%[2]。NSCLC占所有肺癌病例的85%以上。不良的结果主要是由于传统化疗药物难以有效渗透肿瘤组织，因为它们更容易被正常组织吸收。通常，只有5%到10%的药物浓度能够到达肿瘤[3]。研究还强调了肿瘤的高侵袭性，表现为其容易扩散到远处器官，并转移到大脑、淋巴结、肝脏、骨骼、脑膜和骨髓等部位[4]。尽管NSCLC的治疗策略有所进展，但早期检测和精确的肿瘤定位仍然是提高患者预后的关键挑战。有效治疗的最大障碍之一是在诊断和手术过程中准确、实时地识别肿瘤边界[5]，然而，这些方法往往缺乏手术中肿瘤定位所需的精度，特别是在肿瘤较小、位置较深或边界不清晰的情况下[6]。成像技术的分辨率限制可能会影响肿瘤的准确可视化，从而增加手术中切除不完全或不必要的健康组织切除的风险。传统的肿瘤标记技术（如使用金属夹或染料）对于小型、难以触及或可移动的肿瘤并不总是可靠的[7]。因此，迫切需要创新的方法，能够在手术过程中实现精确、实时的肿瘤定位，从而减少残留肿瘤组织的可能性，并提高患者的长期生存率。
c-Met是一种由MET原癌基因编码的受体酪氨酸激酶，作为肝细胞生长因子（HGF）的细胞表面受体[8]。在多种癌症中，c-Met/HGF轴通过MET基因组扩增、转录上调和配体依赖性激活等机制发生失调，导致肿瘤进展、血管生成增加、侵袭性增强、转移率上升以及药物耐药性增加[9]。在NSCLC中，大约三分之二的患者存在致癌驱动突变，关键的下游信号通路（如PI3K/AKT/mTOR和Ras-Raf-MEK-ERK（MAPK）经常被过度激活[8]。这些突变，包括EGFR、KRAS、BRAF、ALK和ROS1中的突变，导致各自信号通路的失调和过度激活，进而推动癌症的恶性进展。针对这些突变设计的靶向疗法已显示出初步的临床疗效；然而，耐药性的出现仍然是一个严峻的挑战，大大限制了治疗效果的持久性[10]、[11]。耐药性可能通过诊断时已存在的固有机制或治疗过程中出现的获得性机制表现出来。值得注意的是，通过c-Met激活的替代信号通路是NSCLC中获得性耐药性的主要驱动因素之一[12]。异常的c-Met信号通路可能由体细胞突变、MET基因组扩增或c-Met受体的过度表达引起[13]。这条通路不仅在肿瘤发生和进展中起核心作用，还是规避靶向治疗（如针对EGFR或ALK的治疗）效果的关键机制。例如，在对EGFR抑制剂（如吉非替尼和厄洛替尼）产生耐药性的情况下，c-Met的扩增常常成为显著的补偿机制，促进肿瘤的持续生长和转移[14]、[15]。因此，靶向异常的c-Met信号通路已成为克服获得性耐药性和抑制NSCLC进展的有力策略，突显了开发新型、特异性和生物相容性的c-Met靶向治疗药物的紧迫需求。
聚集诱导发射发光体（AIEgens）具有高亮度、优异的光稳定性和增强的荧光强度，并且在聚集状态下能够生成活性氧（ROS），使其成为图像引导的癌症治疗和诊断的理想荧光材料[16]、[17]。先前的研究表明，基于AIE的制剂在光动力疗法（PDT）和/或光热疗法（PTT）中具有相当大的潜力[18]。然而，它们在临床应用方面仍面临一些挑战，包括非特异性、稳定性不足和循环半衰期短等问题，导致肿瘤积累不足和对健康组织的潜在副作用。研究人员认为，改善表面特性可以使AIE聚集体具有更高的特异性、更长的循环时间和降低的细胞毒性，从而有助于它们穿透生物屏障，实现更有效的肺癌治疗[19]。
在这项研究中，我们设计并合成了一种新型的自组装AIE化合物，其序列为TPE-FFNPGYGKSLSRHDHIHHHPLGVR-PEG6。该化合物具有独特的结构元素：一端的四苯乙烯（TPE）和酰胺化的二肽苯丙氨酸（FF），赋予其强大的疏水性。NPGY序列作为功能性溶酶体靶向基序，而KSLSRHDHIHHH则被设计为c-Met结合序列。此外，PLGVR段旨在被MMP2酶切割，PEG6作为亲水部分以增强溶解性和生物相容性。这种化合物具有两亲性结构，能够在肿瘤微环境中自发组织成纳米级结构，利用了MMP2酶的高表达。当亲水PEG部分被酶切割后，疏水的TPE和FF成分会协同组装成原位纳米纤维，暴露出与肿瘤细胞c-Met受体选择性结合的关键基序。这种相互作用触发AIE效应，实现基于荧光的精确追踪能力。该化合物具有两亲性结构，能够在肿瘤微环境中自发组织成纳米结构，响应MMP2酶的高表达水平。当亲水PEG段被酶切割后，疏水的TPE和FF成分会聚集形成原位纳米纤维，揭示出与肿瘤细胞c-Met受体选择性结合的特定基序。这种结合启动了AIE效应，实现了基于荧光的精确细胞活性追踪（见图1和表1）。（见表2。）
部分片段
通过固相肽合成制备AIEnp
肽类由GenScript使用固相FMOC方法合成，并与TPE-NHS（西安启越生物）偶联。TPE偶联的肽类通过固相肽合成（SPPS）在Wang树脂上进行合成，采用C→N末端延伸策略。该流程包括树脂预处理、定点PEG6偶联、逐步肽链延伸、N末端TPE偶联、切割纯化和结构确认。PEG6作为
基于多肽的AIE纳米颗粒（AIEnps）的特性
AIEnps通过多种分析技术进行了表征。肽类首先通过固相合成制备，然后在氨基末端与TPE-NHS偶联。HPLC分析阐明了化合物的纯度（图2A），而质谱确认了分子量和合成的有效性（图2B）。TEM分析显示，在MMP2酶水解之前，AIEnps呈现球形形态，随后转变为线性结构
讨论
对于非小细胞肺癌（NSCLC）来说，由于高复发率、不良的生存结果以及传统疗法（如药物耐药性和全身毒性）的局限性，开发有效的治疗策略仍然是一个主要的临床挑战。值得注意的是，异常的c-Met信号传导是NSCLC肿瘤发生和转移的关键驱动因素[22]。在这项研究中，我们设计了靶向c-Met的聚集诱导发射纳米颗粒（AIEnps）——一种自组装的肽基
结论
本研究通过SPPS和N末端TPE偶联制备了基于多肽的AIEnps，纯度和AIE活性均得到验证。TEM证实了它们对MMP2的响应性形态转变，并且在生理环境中保持了稳定性。体外实验表明，AIEnps具有肿瘤选择性细胞毒性和良好的生物相容性，能够靶向c-Met，破坏下游通路，诱导MET激活，并抑制肿瘤迁移和干性。AIEnps是用于NSCLC的有前景的c-Met靶向纳米治疗药物。
CRediT作者贡献声明
任振：撰写——原始草稿，数据管理，概念化。李帅：撰写——原始草稿，可视化，验证，数据管理，概念化。崔彤：软件，资金获取，正式分析，数据管理，概念化。朱天杰：项目管理，方法学，研究，资金获取，正式分析。丁大鹏：撰写——审稿与编辑，可视化，验证，监督。赵京源：监督，软件，资源，项目
资助
本研究得到了辽宁省重点研发项目（2024JH2/10250004）、大连市重大科技创新项目（2023JJ11CG005）、辽宁省科技计划联合项目（2024JH2/102600013）和大连市生命健康领域指导项目（2023YGZD02）的支持。
