TCA-miR-137-5p 通过靶向 Tribolium castaneum 中的 CYP346B3 基因来调节磷化物抗性

《Journal of Stored Products Research》：tca-miR-137-5p modulates phosphine resistance by targeting CYP346B3 in Tribolium castaneum

本研究通过RNA干扰和荧光素酶报告基因实验，证实tca-miR-137-5p通过结合CYP346B3基因的编码序列调控其表达，从而影响磷化氢抗性。实验表明，注射agomir可显著降低CYP346B3表达，并提高磷化氢处理下的幼虫死亡率，揭示了miRNA在抗性机制中的新作用。

作者：Sheung Taek Oh、Rashmi Manohar Mahalle、Jun Won Shin、Keon Mook Seong

韩国忠南国立大学农业与生命科学学院应用生物学系，大田市，34134

摘要

磷化氢被广泛用作熏蒸剂，用于检疫处理和储存产品害虫的管理。然而，其长期和密集的使用导致包括Tribolium castaneum（红粉甲虫）在内的多种昆虫物种产生了抗性。在昆虫中，细胞色素P450在杀虫剂机制中起着重要作用。尽管已有报道称在具有磷化氢抗性的T. castaneum中CYP346B3过度表达，但其背后的机制仍不清楚。本研究证实tca-miR-137-5p调节CYP346B3的表达。荧光素酶报告基因检测提供了直接证据，表明tca-miR-137-5p与CYP346B3的编码序列（CDS）结合，从而调节其表达。当将tca-miR-137-5p agomir注射到PH₃-R品系幼虫中时，48小时后CYP346B3的表达减少了23%，72小时后减少了50%。此外，在将tca-miR-137-5p agomir注射到PH₃-R品系幼虫后，磷化氢处理的存活率比未注射agomir的对照组低20%。总体而言，这些结果表明tca-miR-137-5p通过CYP346B3的转录后调控参与磷化氢抗性的形成，为基于miRNA的T. castaneum抗性诊断和管理方法的发展提供了重要的基础信息。

引言

收获后的害虫管理对于确保全球粮食安全至关重要，因为它可以最小化害虫侵扰造成的损失，并保持储存农产品的长期使用质量（Shen等人，2023年）。在可用的害虫控制策略中，熏蒸是首选方法，而磷化氢因其快速作用、成本效益、快速扩散以及处理产品上的残留物最少而成为首选熏蒸剂（Kim等人，2019年）。然而，对磷化氢的过度依赖导致了多种害虫物种的广泛抗性，这对它的持续有效性构成了重大威胁（Jagadeesan等人，2012年；Nayak等人，2020年；Wang等人，2006年）。这一日益严峻的挑战凸显了探索替代方法并揭示磷化氢抗性背后的分子机制的紧迫性，以确保可持续的害虫管理。Tribolium castaneum（鞘翅目：拟步甲科），通常被称为红粉甲虫，是一种普遍侵扰热带和亚热带地区储存农产品的害虫（Bell，2000年）。尽管有报道称来自美国、巴西、澳大利亚、印度和中国的T. castaneum对磷化氢具有很强的抗性（Wang等人，2020年），但韩国的T. castaneum种群仍然对磷化氢敏感（Kim等人，2024年）。在T. castaneum的磷化氢抗性机制中，已报道二氢脂酰胺脱氢酶（dld）基因的点突变对其抗性有显著贡献（Schlipalius等人，2012年）。特别是P45S和G131S突变与强抗性相关（Chen等人，2015年；Hubhachen等人，2020年）。此外，来自中国和印度的磷化氢抗性T. castaneum种群表现出细胞色素P450s的表达升高，表明CYP346家族基因的过度表达有助于磷化氢抗性（Deeksha等人，2024年；Wang等人，2020年）。磷化氢抗性的日益普遍强调了研究其遗传和分子机制的必要性，以改进害虫控制策略。

微小RNA（miRNAs）是约22个核苷酸的非编码RNA，对转录后调控至关重要，影响许多细胞功能和发育途径（Singh和Nagaraju，2008年）。miRNAs主要通过与目标信使RNA（mRNAs）的3′非翻译区（UTRs）结合来发挥作用，导致翻译抑制或mRNA降解（Lee和Ambros，2001年）。T. castaneum中的miRNA库比Drosophila melanogaster的大约大15%，使其成为基因进化比较研究的宝贵模型（Marco等人，2010年；Richards等人，2008年）。此外，越来越多的证据表明，miRNAs还通过调节解毒酶和应激反应途径在杀虫剂抗性中起关键作用，从而帮助害虫适应化学控制策略（Mahalle等人，2024年）。先前的研究报道novel_85和novel_191通过靶向CYP6ER1和CarE1来调节Nilaparvata lugens的对硝基吡虫啉抗性（Mao等人，2022年）。同样，在Spodoptera frugiperda中，miR-278-5p、miR-13b-3p、miR-10485-5p和miR-10483-5p的过度表达显著增加了对氰traniliprole和emamectin benzoate的死亡率（Sun等人，2019年；Yang等人，2021年）。这些研究表明，miRNAs在昆虫杀虫剂抗性中起着关键调节作用。

先前的计算和测序研究已经鉴定了T. castaneum中的多种miRNAs，根据miRBase v21.0的数据，该物种中已鉴定并注释了大约342个miRNA前体和430个成熟miRNAs（Wu等人，2017年）。

尽管在T. castaneum中进行了大量的功能基因组学研究，但miRNAs在磷化氢抗性中的作用仍不清楚。为了研究这一点，将具有磷化氢抗性的品系（PH₃-R）与对磷化氢敏感的品系（PH₃-S）进行比较，以分析小RNA表达谱，从而识别出表达变化显著的几种miRNAs及其预测的目标基因。使用miRNA模拟物和荧光素酶报告基因检测对选定的miRNA–mRNA对进行了功能验证，发现miRNA丰度的调节通过调节解毒相关基因的表达来改变磷化氢敏感性。总体而言，这项研究揭示了磷化氢抗性背后的另一种转录后调控机制，并确定了开发更有效害虫管理策略的潜在分子靶点。

实验部分

昆虫饲养

T. castaneum的磷化氢抗性品系（PH₃-R）和对磷化氢敏感的品系（PH₃-S）由韩国植物检疫技术中心提供。这两种品系均在添加了10%（w/w）酵母（Lesaffre，500克，中国）的灭菌小麦粉上培养，并在忠南国立大学（大田市，韩国）的受控实验室条件下维持（25 ± 2°C和60-70%相对湿度，16L:8D光照周期）。

RNA提取和文库构建

从T. castaneum中提取总RNA

PH₃-R和PH₃-S品系中的小RNA表达谱分析

每个组使用三个生物学重复样本，我们从PH₃-R和PH₃-S品系构建了六个miRNA文库。抗性和敏感品系的文库分别产生了724万至1225万和1212万至1222万条原始读段。经过质量过滤（去除低质量读段、接头和污染物）后，保留了18-30个nt的读段进行分析；PH₃-R品系的修剪读段比例为30.42-41.04%，PH₃-S品系的修剪读段比例为15.56-20.29%，其中52.90-61.88%

讨论

尽管磷化氢长期以来一直用于控制储存谷物中的害虫，但仍有研究致力于确定其分子机制，因为已在多个地区报告了抗性的出现（Benhalima等人，2004年；Pimentel等人，2007年）。在Tribolium castaneum中，磷化氢抗性不仅与dld基因的突变有关，还与CYP346家族基因的持续过度表达有关，这表明解毒过程在抗性的发展中起着重要作用（Deeksha等人）

CRediT作者贡献声明

Sheung Taek Oh：撰写原始草稿、可视化、验证、研究、正式分析、数据管理。 Rashmi Manohar Mahalle：撰写原始草稿、可视化、验证、研究、数据管理。 Jun Won Shin：可视化、研究、正式分析。 Keon Mook Seong：撰写、审稿与编辑、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了韩国动植物检疫局动物和植物检疫技术研发（R&D）项目（项目编号：Z-1543086-2023-25-02）的支持。