《Chemistry & Biodiversity》：Isolation, RP-UHPLC-ESI-LIT-Orbitrap-MS/MS-Based Metabolic Profiling and Anticandidal Activity of the Root and Leaf Secondary Metabolites of Monotes Kerstingii Gilg (Dipterocarpaceae)
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本研究报告了从角果木（Monotes kerstingii）的根和叶中分离鉴定出28种次生代谢物，包括6个新化合物。通过RP-UHPLC-ESI-LIT-Orbitrap-MS/MS技术分析了其代谢谱，并对粗提物及单体化合物进行了系统的抗念珠菌（anti-Candida）活性评估，揭示了其抑制多种临床念珠菌菌株（包括C. albicans, C. krusei等）的潜力。其中，化合物7展现出优异的抗念珠菌活性，最小抑菌浓度（MIC）低至7.8 μg/mL，为开发新型抗真菌药物提供了有前景的候选分子。
引言
念珠菌（Candida）属是人类共生微生物群的组成部分，通常存在于皮肤、胃肠道和生殖道。然而，在易感人群（如老年人、住院患者和免疫抑制个体）中，它们会引起各种感染。全球系统性分析强调了侵袭性念珠菌感染的流行病学变化，非白色念珠菌等不常见物种的发病率不断增加，其抗真菌药敏模式和临床结局带来了独特的挑战。最常见的侵袭性感染物种包括白色念珠菌（C. albicans）、光滑念珠菌（C. glabrata）、近平滑念珠菌（C. parapsilosis）、热带念珠菌（C. tropicalis）和克柔念珠菌（C. krusei）。其中，白色念珠菌约占念珠菌血症病例的37.1%，而光滑念珠菌和近平滑念珠菌分别占美国2017年至2021年培养确诊的血液感染病例的30.4%和13.5%。对最常用抗真菌药物的耐药性出现，已成为全球公共卫生的严重威胁。据统计，有超过3.4万例病例和1700例死亡归因于耐药性念珠菌。鉴于念珠菌病的流行及其与医疗资源不足和耐药性的相关性，迫切需要新的治疗替代方案。药用植物可以作为发现念珠菌生长抑制剂的重要基础。非洲热带森林拥有丰富的生物多样性，已知约有8620种植物具有药用特性。其中，角果木属（Monotes）植物在非洲各国分布，包含36个物种，在传统医学中用于治疗腹泻、伤寒、咳嗽和皮肤病。据我们所知，角果木（Monotes kerstingii）是目前在喀麦隆（北部地区）发现的该属的唯一物种。然而，迄今为止对该属进行的化学研究很少，此前对角果木树皮和叶片的研究表明，stilbene-coumarins和鞣花酸衍生物是树皮的主要成分，而类黄酮仅存在于叶片中。本工作旨在深入研究角果木根部提取物对五种临床念珠菌分离株的生物活性成分，并对叶片提取物进行更深入的探究。本报告包括角果木根和叶提取物的抗念珠菌活性、其次生代谢物的分离，以及首次从自然界中报道的cis-stilbene-coumarin，同时结合了快速靶向的RP-UHPLC-ESI-LIT-Orbitrap-MS/MS代谢谱分析。
结果与讨论
分离化合物的结构解析
对角果木根和叶提取物进行化学研究，通过Diaion HP-20、硅胶、Sephadex LH-20结合半制备型高效液相色谱，分离并鉴定了28种次生代谢物，包括6个新化合物（1–6）。
化合物1的结构解析
化合物1从正己烷/乙酸乙酯（80:20, v/v）混合物中获得，为粉色油状物，可溶于甲醇。其分子式为C25H30O9。通过综合核磁共振谱分析，确定其为一种糖基化的stilbene（二苯乙烯）衍生物，并鉴定其糖基为β-D-吡喃葡萄糖基。该糖基连接在stilbene部分的C-4′′′位上。因此，化合物1被鉴定为{5-[(1E)-2-(4-β-D-吡喃葡萄糖基苯氧基)乙烯基]-4′-甲氧基苯基}-2-甲基-1-丙酮，命名为kerstingioside。
化合物2的结构解析
化合物2为黄色粉末，可溶于DMSO。其分子式为C19H16O5。其1H-NMR谱显示两个烯烃质子的偶合常数约为12 Hz，表明双键为cis（顺式）构型。这是首次从自然界中分离得到的cis型stilbene-coumarin，被命名为cis-kerstilbcoumarin A。
化合物3的结构解析
化合物3从正己烷/丙酮（80:20, v/v）溶剂系统获得，为淡绿色粉末，可溶于丙酮。其分子式为C20H18O5。其NMR数据表明，它是以cis和trans（反式）立体异构体不可分割的混合物形式存在。其中，cis异构体是此前未描述的化合物，被命名为cis-kerstilbcoumarin B。
化合物4的结构解析
化合物4从正己烷/丙酮25:75（v/v）系统获得，为白色粉末，可溶于DMSO。其分子式为C25H26O10。与化合物2类似，其NMR数据也表明是cis和trans立体异构体的混合物。结构中还包含一个β-D-吡喃半乳糖基，连接在C-4′′位。这是首次从自然界中报道的另一种cis-stilbene-coumarin，被命名为cis-kerstilbcoumarin C。
值得注意的是，在我们之前对同一地区采集的该植物茎皮的研究中，没有发现任何cis-stilbene-coumarin。根部存在较不稳定的cis立体异构体，可能是因为根部不像茎皮那样暴露在阳光下。因此，在喀麦隆极北地区阳光强烈的环境下，暴露在紫外线下时，茎皮中的cis立体异构体可能迅速异构化为更稳定的trans立体异构体。
化合物5的结构解析
化合物5从正己烷/乙酸乙酯80:20（v/v）混合物中获得，为白色粉末，可溶于DMSO。其分子式确定为C20H20O6。通过综合分析，确定其为一个黄烷酮（flavanone）类化合物，并带有一个与A环在C-6/7位线性稠合的二氢吡喃环。通过ECD谱和旋光度与已知化合物比较，确定了其C-2位的绝对构型为S。该化合物被命名为kerstingiiflavanone。
化合物6的结构解析
化合物6从正己烷/丙酮（75:25, v/v）混合物中获得，为黄色无定形粉末，可溶于氯仿。其分子式为C68H122O7。通过核磁共振谱分析，确定其具有stigmasta-5,22-二烯骨架，并连接有一个β-D-吡喃葡萄糖基。此外，还存在一个长链脂肪酰基，通过酯键连接在糖基的C-6′位上。该脂肪酸链的长度经分子式计算确定为31个碳。因此，化合物6被鉴定为3-O-[6’-O-三十一烷酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-β-谷甾醇，命名为monestoside B。
基于对NMR谱图的解析，并结合文献数据，另外22种已知次生代谢物也得到了完全鉴定。其中包括stilbene衍生物（如化合物7、8）、stilbene-coumarins（9、10、11）、鞣花酸衍生物（12、13）、类黄酮（14–21，包括槲皮素、异槲皮苷、金丝桃苷、4′,7-二甲氧基山柰酚、7-O-(3-甲基-2-丁烯基)山柰酚、tiliroside、6-(1,1-二甲基烯丙基)柚皮素等）、甾体（22、23，为豆甾醇和β-谷甾醇的混合物及豆甾醇葡萄糖苷）、三萜（24桦木酸、253-O-β-D-吡喃葡萄糖基齐墩果酸）以及苯甲酸衍生物（264-羟基苯甲酸）、香豆素（27noreugenin）和酚苷（28bergenin）。
RP-UHPLC-ESI-LIT-Orbitrap-MS/MS分析
为确认所有分离的化合物最初存在于提取物中，进行了快速靶向的RP-UHPLC-ESI-LIT-Orbitrap-MS/MS代谢谱分析。液相色谱-高分辨率Orbitrap质谱法在角果木根和叶提取物的总离子流色谱图中，分别注释了10种和8种代谢物。质谱法有一些固有的局限性，例如，它无法区分cis/trans异构体（如化合物3和10），也无法区分异槲皮苷和金丝桃苷这类同分异构体。
抗念珠菌活性评估
对来自角果木根和叶的不同粗提物以及部分分离化合物，针对五种临床念珠菌分离株（白色念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌）进行了抗念珠菌活性评估，测定了最小抑菌浓度（MIC）。
粗提物的活性
来自两种器官（根和叶）的提取物对五种念珠菌的MIC值范围在3.9至2000 μg/mL之间。其中，叶的氢乙醇提取物（EMKL）活性最强，对克柔念珠菌、近平滑念珠菌和白色念珠菌的MIC值分别为3.9、15.6和31.5 μg/mL。相比之下，根部提取物对所有测试菌株的MIC值均≥1000 μg/mL，活性较低。
纯化合物的活性
对分离得到的化合物进行了筛选。其中，stilbene衍生物7是最具活性的成分，对白色念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌的MIC值分别为7.8、15.6和15.6 μg/mL。而化合物14（槲皮素）和15（异槲皮苷）仅表现出中等活性，对白色念珠菌的MIC值为250 μg/mL，对其他菌株的MIC值为500 μg/mL。其余测试的化合物（包括新化合物1-6）在测试浓度下（高达500 μg/mL）未显示出显著的抗念珠菌活性。
