《Journal of Basic Microbiology》：Aspergillus conicus Endophyte Improves the Development of Eucalyptus camaldulensis Seedlings In Vitro
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本研究揭示了曲霉属内生真菌Aspergillus conicus与赤桉幼苗之间有益的共生关系。通过体内外实验证实，该真菌不仅能广泛定殖于植株根部、茎部和叶片，还能显著促进幼苗的地上部分生长、叶片数和生物量积累，并提高种子萌发率。其产生的生物活性化合物可能抑制了种子内源病原菌，展现了其在桉树培育中作为生物接种剂的巨大潜力。
引言：真菌与植物的互利共生
真菌与植物之间的共生关系是陆地生态系统中至关重要的生态现象，对生态系统健康和农业生产力具有关键作用。研究显示，这种共生关系能带来多方面的互利效益，包括促进植物养分吸收、抵御病原体以及维护土壤健康。曲霉属真菌在生态系统中扮演着重要角色，它们能够提高植物对磷等低移动性养分的吸收效率，分泌生物活性物质以刺激植物生长发育，并增强植物对干旱、盐分等环境胁迫的抵抗力。此外，某些曲霉种类还能作为生物防治剂，通过产生抗菌化合物来保护植物免受多种病原体侵害。这些特性对于可持续农业和退化生态系统的恢复至关重要。在可持续林业中，战略性利用曲霉属等有益真菌，有望改善林木生长与健康，协助退化土壤的恢复，并提供对病虫害的生物防治。
为满足日益增长的市场需求，赋予植物优良的生理和遗传特性至关重要。内生真菌，尤其是曲霉属真菌，已成为促进植物生长、农作物病虫害生物防治、养分溶解和激素生产等方面的战略盟友。分子鉴定技术和生物测定方法深化了我们对与桉属植物相关真菌的认识。其中，核糖体DNA的内部转录间隔区因其高度变异和保守的特性，被广泛应用于真菌鉴定。
基于上述背景，本研究旨在鉴定一种对植物潜在有益的真菌分离株，并探究真菌-植物互作对赤桉试管苗发育的影响。
材料与方法
2.1 内生真菌的分离
真菌接种物直接分离自自然定殖了真菌的赤桉幼苗。种子在添加了改良Murashige和Skoog培养基的培养皿中培育。分离出的菌株被转移至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在25°C ± 2°C、12小时光周期的气候室中培养，以获得纯真菌菌落。
2.2 真菌分离株的形态学与分子鉴定及系统发育分析
通过形态学特征对真菌分离株进行初步表征。为促进快速生长和孢子产生，将分离株在嗜干培养基中培养。培养物送至分子鉴定实验室进行DNA表征、聚合酶链式反应和rDNA基因测序。PCR使用通用引物ITS1和ITS4进行。测序采用桑格法在Applied Biosystems 3730XL仪器上进行。获得的rDNA ITS区序列提交至美国国家生物技术信息中心GenBank数据库，获得登录号MZ088045。利用MEGA 11软件，采用邻接法和Jukes and Cantor DNA测序参数对序列进行分析。
2.3 赤桉幼苗的离体内生定殖
赤桉种子用2%有效氯的次氯酸钠表面消毒。在25°C ± 2°C、12小时光周期的气候室中培养7天后，从每个培养皿中选取10株最健壮的幼苗，移植到含有Murashige和Skoog培养基的试管中。移植三天后，将三块直径10毫米的活跃生长内生真菌菌落圆片接种到每个试管中。接种15天后评估幼苗的生物特征。
2.4 内生定殖的确定
采用改良的方法评估内生定殖。将植物各部分在层流超净工作台中切段，并用70%酒精和2%次氯酸钠进行表面灭菌，然后用无菌蒸馏水清洗。将片段置于添加了250 mg/L氯霉素的PDA培养基培养皿中，在气候室中培养7天。
2.5 生物测定参数
实验采用完全随机设计，设两个处理，10次重复。一组为对照，另一组接种真菌分离株。评估的形态参数包括幼苗高度、叶片数、地上部鲜重、地上部干重、根部鲜重和根部干重。干重通过将样品在60°C烘箱中烘干至恒重后测定。
2.6 真菌滤液制备
将真菌分离株在PDA培养基上扩繁。培养7天后，将三个菌丝盘转移到含有300毫升液体培养基的锥形瓶中，在28°C ± 2°C、100 rpm的摇床培养箱中培养15天。培养后，取培养基上清液，通过Whatman? 1号滤膜过滤，获得不含细胞的真菌滤液。通过超声处理确保完全去除残留菌丝，并通过在PDA培养基上培养验证滤液的无菌性。
2.7 赤桉种子的离体萌发
赤桉种子萌发生物测定使用三张用无菌蒸馏水湿润的发芽试纸进行。实验设置三个处理：对照组、T1处理组和T2处理组。每组使用400粒种子，分为10个重复。种子在25°C ± 2°C、12小时光周期的气候室中培养，每天记录萌发情况，持续7天。根长超过2毫米的种子计入统计。
2.8 吲哚-3-乙酸产生的分析
为测定植物生长素IAA的产生和浓度，将分离的A. conicus在Czapek液体培养基中，于28°C ± 2°C、120 rpm的摇床中培养7天。培养基过滤后酸化，用甲醇溶解浓缩。使用Salkowski试剂，通过分光光度法在535 nm波长下测定IAA浓度。
2.9 统计分析
使用Statistica? 7.0软件进行方差分析。对于包含三组的萌发实验，使用Tukey检验在5%显著性水平上比较均值。在其他实验中，使用学生t检验比较两个独立样本的均值，并使用比例比较检验比较接种效率比例，显著性均设为5%。当样本不符合参数检验假设时，使用非参数Kruskal-Wallis检验在相同显著性水平进行分析。
结果
3.1 真菌分离株的鉴定
基于形态特征和rDNA ITS区的分子分析，鉴定该真菌为Aspergillus conicus。在特定培养基上，年轻菌落呈白色，菌丝体絮状，背面浅黄色，边缘丝状。成熟菌落呈浅灰色，菌丝体絮状，背面深褐色，边缘丝状。两个阶段的菌丝均为透明，孢子球形，生长适中，质地柔软。
rDNA ITS区序列已存入GenBank。系统发育分析构建的进化树将该分离株置于曲霉属内，与限制组其他成员聚在一起。该分离株与A. conicus序列的相似性为99.32%，覆盖率为100%。这些结果支持了该物种的鉴定，并确认其属于子囊菌门散囊菌纲。这些真菌的特征是具有隔膜菌丝并通过孢子繁殖。基于形态学和分子分析的结合，该分离株被鉴定为与A. conicus在分类学上密切相关。
3.2 内生定殖
为探究A. conicus在不同植物组织中的定殖程度，研究了其对赤桉的内生定殖。接种十天后分析的定殖频率在根部最高（80%），其次是叶片（60%）和茎部（30%）。这些结果表明该真菌对植物根系有偏好性。
在对照培养皿中未发现真菌菌落，表明灭菌程序有效，且生长的内生真菌源自赤桉幼苗的营养组织。偶尔从接种的植物组织中观察到污染真菌和细菌的生长，但这种情况很少见。总之，结果表明A. conicus能够作为内生菌定殖，且定殖主要发生在根部。
3.3 生物测定参数
评估了内生真菌A. conicus对赤桉幼苗生物测定参数的影响。在所有分析的形态测量变量中，接种A. conicus的幼苗与对照组幼苗之间存在显著差异。接种幼苗的高度显著高于未接种幼苗。
根长也存在显著差异；对照组的根生长大于用真菌分离株处理的组。在根部和地上部的鲜重和干重方面，处理和对照之间存在显著差异，真菌处理组显示出更高的值。此外，各处理间的叶片数量也存在显著差异。
与内生真菌A. conicus相关的幼苗平均叶片数显著高于对照组。接种了内生真菌分离株的植物的地上部鲜重显著高于未接种植物。与对照组相比，真菌接种组的地上部分高度增加更为显著。总体而言，这些结果表明，在测试条件下，A. conicus对赤桉幼苗的生长和生物量积累有积极影响。
3.4 赤桉种子萌发分析
研究了真菌处理对赤桉种子萌发的影响。T1处理中约98%的种子在评估期内萌发且未受真菌感染，证明了该处理的有效性。相比之下，在对照组和真菌滤液处理组的赤桉种子中均检测到真菌污染，这可能影响了幼苗的发育。在这些组中，没有萌发的幼苗存活，说明了真菌污染的严重性。
3.5 真菌分离株产生IAA的量化
由于吲哚乙酸是一种促进植物生长的植物激素，研究了真菌分离株产生IAA的能力。光谱分析显示，真菌分离株的IAA产量低于该方法的检测限。这些结果表明，在实验条件下，测试菌株没有显著的IAA生产能力。
讨论
本研究旨在探讨内生真菌A. conicus与赤桉幼苗之间的共生相互作用，重点关注其对植物生长、种子萌发和定殖模式的影响。该分离株成功定殖于赤桉幼苗的根、叶和茎，这可以解释为该分离株属于一个在世界各地土壤中广泛分布的多样化属。这个属以其在多变环境条件下发育的能力而闻名，这有利于其与宿主植物的相互作用。
此外，土壤为微生物的发育提供了有利条件。本研究中使用的离体技术对于促进和观察定殖至关重要，因为它使幼苗能够在无菌培养基中，在受控的光照、温度和其他因素下培养，最大限度地减少了外部污染物的干扰。然而，该技术存在离体系统固有的局限性。一些桉树物种和杂交种被描述为对离体培养具有顽拗性，在愈伤组织诱导、器官发生、芽再生、不定根形成，尤其是在移栽到田间条件前的适应阶段存在困难，死亡率很高。
这一结果印证了内生真菌与宿主植物之间相互作用的特异性这一有据可查的现象，即每种植物物种往往拥有一组特定的内生真菌，这些真菌被认为是高度多样化的。A. conicus能够定殖赤桉的不同器官，表明只要满足其生存的最低要求，该真菌可以适应植物体内的不同生态位。这种定殖可以影响养分获取和生长，但其具体机制仍有待阐明。
先前的研究表明，Aspergillus flavipes可以定殖桉树的所有营养器官，并刺激植物生根和发育。这些结果表明，曲霉属真菌对植物的定殖是调节土壤-植物系统的关键因素，不仅作为生长促进剂，还作为对抗非生物和生物胁迫的保护剂。
尽管对植物有益，但本研究中分离的内生菌是人类的机会性病原体，可在免疫功能低下个体中引起严重的眼部感染。这种双重性强调需要进一步研究A. conicus与其宿主之间的相互作用机制，以及其大规模用于林业的相关风险。使用内生真菌作为生物接种剂时，不仅应考虑其对植物的益处，还应考虑其对人类健康和生态系统的潜在影响。
关于生物测定特征，与对照处理相比，接种内生真菌A. conicus增加了赤桉幼苗的评估变量。这些结果与先前的研究一致，表明曲霉属真菌可以显著改善植物生长和非生物胁迫耐受性。该属的几种物种，如Aspergillus PB-7、Aspergillus niger、Aspergillus tamarii、Aspergillus awamori和Aspergillus cejpii DMKU-R3G3，可以产生IAA、赤霉素和其他刺激植物生长的化合物。
IAA由多种内生真菌产生，直接影响植物的根和地上部生长。在实验条件下未证明A. conicus产生IAA。然而，大多数曲霉分离株和其他真菌可能具有其他活性，例如产生赤霉素，这需要进一步研究。曲霉物种改善植物生长和胁迫耐受性的能力已有充分记载。A. conicus定殖赤桉根、叶和茎的能力可能有助于其促进地上部生长和生物量积累，正如本研究所观察到的。然而，对照组表现出更长的根长，表明真菌的存在可能通过促进地上部生长而非根部生长来影响植物体内的资源分配。
此外，本研究的结果揭示了与赤桉种子中抵抗了消毒过程的真菌污染物相关的重大挑战。对照组C和处理组T2均含有污染物，这影响了幼苗的发育和存活，与未显示污染物的T1组形成对比。这种消毒后的污染主要可归因于种子内部携带的潜伏真菌，或可能是在实验设置过程中沉积的空气传播真菌。
观察到的T1组与其他组之间的差异可归因于种子在真菌滤液中浸泡了24小时，这使得种子能够更多地吸收由内生菌A. conicus产生的可能具有抗菌作用的生物活性化合物。已知曲霉物种产生具有广谱抗真菌和抗菌特性的生物碱、萜类和肽类等化合物，这表明该分离株抑制了种子中的潜伏污染物，防止其在萌发期间增殖。在其他处理组中未观察到这些效应，由于缺乏或不足的这些生物活性化合物，导致真菌污染并损害了萌发和幼苗发育。
本研究首次鉴定并证明了真菌A. conicus与赤桉幼苗之间存在积极关联。结果表明，该内生菌促进了桉树幼苗的发育，并可能抑制了与种子相关的病原体。这些真菌代谢物的鉴定是开发基于A. conicus、适用于桉树栽培的生物接种剂的一个有前景的领域。
