《Plant Physiology and Biochemistry》：Genome-wide identification and functional analysis of GRAS transcription factors in
Perilla frutescens reveals the positive role of
PfGRAS70 in regulating rosmarinic acid biosynthesis
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紫苏是重要的药用芳香植物，其标志性成分迷迭香酸具有多种药理活性。本研究首次在全基因组水平系统鉴定了紫苏的83个GRAS转录因子，并深入解析了其中PfGRAS70的功能。研究发现PfGRAS70定位于细胞核和质膜，具有转录激活活性，并通过结合PfC4H4启动子上的TTTCATGT基序促进其表达，最终显著提高发根中迷迭香酸的含量。该成果揭示了GRAS转录因子在紫苏迷迭香酸生物合成中的调控机制，为紫苏分子育种和品质改良提供了理论基础和新靶点。
紫苏，这株在中华大地上被栽培了两千余年的药食同源植物，不仅是厨房里增香的佳品，更是中医药宝库中的重要成员。它的叶、果实、茎均可入药，被《中国药典》所收载。在众多活性成分中，一种名为迷迭香酸(RA)的酚酸类化合物尤为突出，它是评价紫苏质量的关键指标性成分，因其卓越的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性而备受关注。为了获取更多、更优质的RA，科学家们一直在努力探索其生物合成的分子开关。
然而，在紫苏体内，负责调控RA合成的“指挥官”图谱仍不完整。一类被称为GRAS的转录因子在其他植物中被证明是调控生长、发育和次生代谢的关键玩家，但在紫苏中，它们的身影和功能却如同笼罩在云雾之中。GRAS家族成员众多，结构复杂，功能多样，它们是否参与了紫苏RA合成的精细调控？如果能找到其中的关键成员，无疑将为定向培育高产RA的紫苏品种提供强大的遗传工具。
为了解开这个谜题，来自吉林农业大学的研究团队在《Plant Physiology and Biochemistry》上发表了一项系统性研究。他们决定对整个紫苏基因组进行一次“人口普查”，找出所有的GRAS家族成员，并从中锁定一位可能对RA合成至关重要的“关键先生”。
关键技术方法：研究者首先利用隐马尔可夫模型(HMM)从紫苏基因组中鉴定出全部GRAS基因。通过系统进化、保守基序、基因结构、染色体定位和共线性分析，对PfGRAS基因家族进行了全面鉴定和特征描述。利用公开的转录组数据分析了基因的组织表达模式。功能研究聚焦于候选基因PfGRAS70，通过同源比对、结构预测、亚细胞定位、转录激活、酵母单杂交(Y1H)和双荧光素酶报告(Dual-LUC)实验验证其DNA结合与转录调控活性。通过在紫苏叶片中诱导发根，构建了PfGRAS70的过表达转基因发根系，并利用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术测定发根中RA的含量变化，结合实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析相关基因的表达水平。
研究结果
3.1. 紫苏GRAS基因的全基因组鉴定
研究首次在紫苏基因组中鉴定出83个GRAS转录因子，并将其按染色体位置依次命名为PfGRAS01至PfGRAS83。这些基因的编码区长度、编码蛋白的氨基酸数目、分子量(MW)和等电点(pI)均表现出广泛的多样性。分析显示，绝大多数PfGRAS蛋白呈酸性。
3.2. 多序列比对与系统进化分析
将83个PfGRAS与拟南芥的33个AtGRAS蛋白一同构建系统进化树。结果显示，紫苏和拟南芥的GRAS蛋白共同分为DELLA、LAS、SCL3、HAM、SCR、SCL4/7、LISCL、SHR和PAT1等9个亚家族。LAS亚家族成员最多(20个)，而SCL4/7亚家族成员最少(2个)，体现了紫苏GRAS家族成员分布的多样性。
3.3. PfGRAS基因的基因结构、保守基序与结构域分析
对PfGRAS基因的结构、保守基序和结构域进行分析后发现，同一亚家族的基因具有相似的保守基序组成和基因结构。值得注意的是，高达85.54%的PfGRAS基因不含内含子。每个PfGRAS蛋白至少含有一个GRAS或GRAS超家族结构域。其中，DELLA亚家族的成员在N端含有DELLA结构域，C端含有GRAS结构域。此外，PfGRAS16还含有一个电压门控氯离子通道(Voltage_gated_CIC)超家族结构域，暗示其可能具有新颖的功能。
3.4. PfGRAS基因的顺式作用元件分析
对PfGRAS基因启动子区的顺式作用元件预测发现，这些启动子中含有大量与光响应、植物激素响应和胁迫响应相关的元件。其中，光响应元件占比最高(55.30%)，其次是植物激素响应元件(22.78%)和胁迫响应元件(16.92%)。激素响应元件中以茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸响应元件最为丰富。这表明PfGRAS基因可能广泛参与紫苏对光照、激素及环境胁迫的响应。
3.5. PfGRAS基因的染色体定位、共线性与进化分析
83个PfGRAS基因不均匀地分布在20条染色体上，其中2号染色体上的基因数量最多(10个)。共线性分析检测到43个片段重复事件和12个串联重复事件，其中串联重复的基因对多数属于LAS亚家族。非同义替换/同义替换(Ka/Ks)比值分析表明，这些重复基因对主要经历了纯化选择。与同科的芝麻(Sesamum indicum)、丹参(Salvia miltiorrhiza)和黄芩(Scutellaria baicalensis)的共线性比较显示，紫苏与芝麻的亲缘关系最近。
3.6. PfGRAS基因在紫苏不同组织中的表达模式
利用已发表的转录组数据分析PfGRAS基因在根、茎、叶中的表达谱。结果显示，24个基因在至少一个组织中高表达，其中12个基因(包括PfGRAS70)在所有组织中均呈现高表达，表明它们可能在紫苏的基础生长和发育中发挥重要作用。PfGRAS70在根和茎中表达最强，在叶中次之。
3.7. PfGRAS70的亚细胞定位与转录激活
亚细胞定位实验表明，PfGRAS70蛋白定位于细胞核和质膜。转录激活实验发现，全长PfGRAS70及其缺失C端的截短体(PfGRAS70△C)在酵母中具有转录激活活性，而缺失N端的截短体则无此活性，证明其转录激活结构域位于N端。
3.8. 酵母单杂交(Y1H)与双荧光素酶报告(Dual-LUC)实验
基于前人研究，GRAS转录因子可能识别TTTCATGT基序，而该基序存在于RA生物合成关键酶基因PfC4H4启动子区内。酵母单杂交实验证实，PfGRAS70能够与含有TTTCATGT基序的序列结合。双荧光素酶报告实验进一步证明，在烟草叶片中共表达PfGRAS70和PfC4H4启动子报告载体，能显著增强荧光素酶活性，表明PfGRAS70可以激活PfC4H4的转录。
3.9. PfGRAS70转基因发根的构建与RA含量测定
为了在体内验证PfGRAS70的功能，研究团队构建了过表达PfGRAS70的紫苏转基因发根系。与空载对照(EV)相比，过表达系(OE)中PfGRAS70的转录水平显著升高。形态上，过表达系与对照无显著差异，但UPLC-MS分析显示，过表达系发根中RA的含量（OE-1: 54.26 mg/g, OE-2: 49.24 mg/g）分别比对照提高了1.76倍和1.60倍。同时，qRT-PCR检测发现，过表达系中PfC4H4的表达水平也显著上调。此外，RA合成途径中的其他关键酶基因Pf4CL和PfRAS的表达也呈上升趋势，但其启动子区未发现TTTCATGT基序，暗示PfGRAS70可能通过间接方式调控它们。
研究结论与重要意义
这项研究首次在紫苏中完成了GRAS转录因子家族的全基因组鉴定与系统性分析，共鉴定出83个成员，并将其分为9个亚家族。研究揭示了该家族主要通过片段重复事件扩张，且与芝麻亲缘关系最近。功能研究聚焦于PAT1亚家族成员PfGRAS70，通过一系列实验证实：PfGRAS70是一个定位于细胞核和质膜的转录激活因子；它能够通过结合RA合成关键酶基因PfC4H4启动子上的TTTCATGT基序，正向调控PfC4H4的表达；在紫苏发根中过表达PfGRAS70能显著提高迷迭香酸的积累量。
这项工作的意义重大。首先，它填补了GRAS转录因子在紫苏这一重要药用植物中功能研究的空白，系统绘制了该家族的“基因组地图”和表达图谱。其次，它成功鉴定并功能验证了PfGRAS70作为RA生物合成的正向调节因子，首次将GRAS家族与紫苏RA合成途径明确关联起来，揭示了其通过直接靶向PfC4H4进行调控的分子机制，为理解RA合成的转录调控网络增添了关键一环。更有趣的是，尽管PfGRAS70与丹参中负调控酚酸合成的SmGRAS2同属PAT1亚家族且C端高度同源，但二者功能相反，这揭示了GRAS转录因子在进化过程中可能发生的功能分化，展现了其调控功能的可塑性和物种特异性。
综上所述，该研究不仅为紫苏GRAS基因家族的后续研究奠定了坚实基础，更重要的是，将PfGRAS70确立为调控RA生物合成的一个潜在关键靶点。这为通过代谢工程或分子育种手段，例如定向编辑或过表达PfGRAS70，来培育高RA含量的优质紫苏品种提供了直接的理论依据和宝贵的基因资源，对于提升紫苏的药用价值和营养价值具有重要的科学意义与应用前景。
