《Postharvest Biology and Technology》：Biocontrol potential and antifungal mechanism of the newly isolated
Bacillus velezensis HAB-10 against
Neopestalotiopsis cubana causing postharvest fruit rot
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真菌病害威胁粮食安全，海南大学团队从黄皮树中分离出16株拮抗菌，经基因组分析鉴定为Bacillus velezensis，其中HAB-10菌株发酵液对9种植物病原菌有广谱抑制活性，可显著降低芒果、黄皮和蓝莓的腐烂率。研究揭示了HAB-10发酵液破坏N. cubana细胞膜及壁结构的机制，并鉴定出 surfactin、fengycin等代谢物，同时通过全基因组测序发现其携带14个抗菌代谢物合成基因簇。
王焕伟|吴春梅|青玉红|秦春秀|毛青山|刘文波|苗伟国
教育部热带农业与林业学院热带植物病虫害绿色防控重点实验室，中国海口570228
摘要
真菌病害对粮食安全构成严重威胁。Neopestalotiopsis cubana是一种致病真菌，会导致具有经济价值的果实发生严重腐烂，目前缺乏有效的、可持续的采后果实管理策略。本研究从番石榴树中分离出16株拮抗菌株，并通过基因组ANI分析鉴定其为Bacillus velezensis。新分离的B. velezensis HAB-10菌株能够产生胞外水解酶，并对测试的9种植物病原微生物表现出广谱抗真菌活性。进一步实验表明，HAB-10无细胞发酵液（CFB）在体外显著抑制了N. cubana的繁殖，并减少了芒果、番石榴和蓝莓的腐烂病害。在抗真菌机制方面，HAB-10 CFB破坏了N. cubana的细胞膜和细胞壁结构，导致严重的细胞空泡化，并引发了活性氧的大量产生。在分子水平上，CFB抑制了与细胞膜和细胞壁合成以及氨基酸代谢相关的多个基因的表达。值得注意的是，LC-MS和GC-MS分析显示HAB-10 CFB含有多种抗真菌代谢产物（如表面活性素、风霉素、杆菌霉素、苯甲醛、3,4-二甲基苯甲醛等）。全基因组测序结果显示，HAB-10菌株携带14个负责潜在抗菌代谢产物生物合成的基因簇。本研究将B. velezensis HAB-10鉴定为一种有前景的生物防治剂，可用于防治由N. cubana引起的果实腐烂病，同时进一步阐明了其抗真菌机制，为未来开发绿色杀菌剂奠定了基础。
引言
水果富含维生素和营养物质，对全球营养安全和经济增长至关重要（Karoney等人，2024年；Rejman等人，2021年），而热带水果生产具有重要的经济价值（Vitti等人，2020年）。然而，真菌病原体造成了严重的经济损失，其残留毒素对人类健康也构成严重威胁（Godana等人，2023年；Nan等人，2022年）。Pestalotiopsis属菌是常见的植物病原体。根据形态学和分子证据，Neopestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis属已被从Pestalotiopsis属中分离出来（Maharachchikumbura等人，2014年）。Neopestalotiopsis属菌株可感染多种植物和果实。例如，Neopestalotiopsis clavispora会导致番石榴果实环腐病（Chen等人，2025a；Madrid等人，2024年）；Neopestalotiopsis rosae和Neopestalotiopsis siciliana已被报道会导致鳄梨茎部病害。Neopestalotiopsis属菌株在草莓种植中导致的产量损失可超过70%（Olivares-Rodriguez G等人，2024年）。近年来，Neopestalotiopsis属菌株还感染了全球多种水果作物，包括芒果（Tao等人，2024年）、番石榴（Kalyani等人，2024年；Wang等人，2024年）、柿子（Qin等人，2023年）、草莓（Madrid等人，2024年；Rotondo等人，2023年）、石榴（Kong等人，2024年）和猕猴桃（Li等人，2023年）。此前我们发现Neopestalotiopsis cubana是中国海南省番石榴采后腐烂病的主要致病微生物（Huang等人，2024年），这凸显了迫切需要有效的控制措施。目前，合成化学杀菌剂是最常用的控制N. cubana病害的方法（Darojat等人，2024年；Essa等人，2018年；Zhou等人，2023年）。然而，频繁使用化学杀菌剂导致了真菌耐药性的产生，增加了对人类健康的风险（Pereira等人，2021年）。因此，亟需有效的、可持续的抗真菌管理策略。
目前，生物防治剂（BCAs）已被证明是替代化学农药的有效手段（Matteo Galli等人，2024年）。BCAs主要分为三类：细菌、真菌和酵母，包括Bacillus属、Streptomyces属、Trichoderma属和Meyerozyma属（Hosseini等人，2024年）。Bacillus属菌以产生耐热内孢子而闻名，这些内孢子有助于在加工和运输过程中保持其生物活性（Payne等人，2024年）。此外，它们还被报道可以预防和控制多种采后病害。例如，Bacillus altitudinis TM22A菌株被用于控制番茄的采后Alternaria腐烂病（Malik等人，2024年）；Bacillus licheniformis HG03被用于防治采后桃子的软腐病（Wang等人，2023年）；Bacillus velezensis L33a对番茄灰霉病表现出强抑制作用（Sun等人，2024年）。近年来，B. velezensis被重新分类为独立物种，与Bacillus subtilis和Bacillus amyloliquefaciens不同（Adeniji等人，2019年；Ye等人，2018a）。代表性的B. velezensis FZB42菌株以其产生的多种抗菌次级代谢产物而闻名（Fan等人，2018年）。B. velezensis菌株产生的抗菌物质主要包括脂肽（LPs）、聚酮（PKs）、铁载体、细菌素和挥发性有机化合物（VOCs）（Rabbee等人，2019年）。此外，这些代谢产物在发酵液中含量丰富（Li等人，2024b），可直接用于控制果实病害（Zhao等人，2022年）。
尽管许多B. velezensis菌株在采后果实中对病原真菌表现出有效的生物控制作用（Wang等人，2022a），但关于它们对抗Neopestalotiopsis属菌的报道仍然较少，其抗真菌机制也尚未完全阐明。此外，B. velezensis》最近被确认为Bacillus属中的一个独立物种（Ye等人，2018a），因此需要进一步研究其生物控制机制，特别是识别其关键抗真菌代谢产物，以用于未来绿色杀菌剂的开发。在本研究中，我们从番石榴树中分离出几株新的拮抗菌株，并鉴定它们属于B. velezensis属。其中，B. velezensis HAB-10表现出潜在的抗真菌活性。接下来，我们旨在：（i）评估B. velezensis HAB-10无细胞发酵液（CFB）在体外和体内的抗N. cubana效果；（ii）研究HAB-10 CFB对抗N. cubana的抗真菌机制；（iii）利用LC-MS和气相色谱-串联质谱（GC-MS）分析HAB-10 CFB中的抗真菌代谢产物；（iv）通过全基因组测序和分析评估新分离菌株HAB-10的生物防治潜力。本研究提供了一种可靠的生物策略，用于控制由N. cubana引起的果实腐烂病，并为绿色杀菌剂的开发提供了候选物质。
微生物和水果材料
所有分离出的拮抗菌株均来源于儋州育种基地的番石榴树，培养于Luria–Bertani（LB）液体培养基中。HAB-10菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）注册，编号为CGMCC No. 36351。测试的植物病原微生物保存在我们的实验室中，包括Pestalotiopsis psidii、Pseudopestalotiopsis theae、Pestalotiopsis microspora、Colletotrichum gloeosporioides等。
针对N. cubana
的菌株分离和筛选我们从中国海南省儋州市的番石榴种质资源库中选取了番石榴树的多个部位（果实、叶片和根部）作为分离来源。共分离出20株具有抗N. cubana潜力的菌株，编号为HAB-10至HAB-29（图1A）。其中16株菌株对N. cubana>表现出有效的抑制作用，抑制率介于63.33%至84.44%之间，被选为进一步研究对象（Leelasuphakul等人，2008年）。
讨论
Pestalotiopsis属菌类是典型的坏死性真菌病原体，可感染多种作物（Pandey等人，2024年），但目前关于其生物防治的研究非常有限。N. cubana是一种致病真菌，会导致多种果实发生严重腐烂，这凸显了迫切需要绿色和有效的控制措施（ávila-Hernández等人，2025年；Xu等人，2025a）。我们从番石榴树中分离出了几株对抗N. cubana的B. velezensis菌株。
结论
本研究分离出一种新的菌株B. velezensis HAB-10，并证明了其作为防治N. cubana引起的果实腐烂病的有前景的生物防治剂的潜力。HAB-10能够产生胞外水解酶，并对测试的9种植物病原微生物表现出广谱抗真菌活性。HAB-10无细胞发酵液（CFB）在体外有效抑制了N. cubana，并显著减少了番石榴、芒果和蓝莓的病害发生。需要进一步研究以深入探讨其抗真菌机制。
作者贡献声明
毛青山：方法学研究。秦春秀：方法学研究。刘文波：初稿撰写、方法学研究、资金获取、数据管理。王焕伟：初稿撰写、项目监督、方法学研究。苗伟国：修订与编辑、初稿撰写、可视化处理、方法学研究、实验设计、资金获取、数据分析、概念构建。吴春梅：方法学研究。青玉红：方法学研究。
利益冲突声明
作者声明在本文的发表过程中不存在任何利益冲突。作者没有可能影响本研究结果的财务或个人利益。
致谢
本研究得到了海南省科技人才创新项目（编号：KJRC2023B14）、国家自然科学基金（编号：32560636）、海南省芒果农业研究系统（编号：HNARS-07-SX）以及国家重点研发计划（编号：2024YFD1400100）的支持。
