《Postharvest Biology and Technology》：Decline of beneficial microbes and proliferation of latent pathogens: Key drivers of postharvest disease in citrus
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柑橘后熟病害中潜伏感染真菌群落动态研究基于ITS测序分析，发现预采收阶段真菌α多样性（Pielou's evenness 0.32，Shannon 3.21，物种丰富度237±12）显著高于储存阶段（0.28，2.93，210±9），β多样性分析显示储存后菌群结构趋于稳定。核心微生物（Leptosphaeria属）丰度在储存3周后下降62.3%（p<0.01），与Alternaria、Fusarium、Colletotrichum等病原菌增殖（增幅达3.8-7.2倍）形成负相关（r=-0.47）。该研究首次揭示柑橘采后真菌网络解体与病害爆发存在时间梯度关联（储存9周后结构复杂度降低41.7%）。
陈江华|徐梦婷|朱婷|杨子怡|刘娟|段杰|林阳|于晓|江道红|傅艳萍
湖北省植物病理学重点实验室，华中农业大学，武汉430070，中国
摘要
除了与伤口相关的感染（如绿霉病、蓝霉病和酸腐病）外，潜伏感染是柑橘类水果（Citrus unshiu）最常见的采后病害类型。这些病害特别难以管理，其潜在的致病机制仍不甚明了。在本研究中，我们使用ITS测序技术监测了从采前发育到储存期间柑橘果实中微生物群落的动态变化。β多样性分析显示真菌群落组成发生了显著变化。值得注意的是，采前发育阶段的变异性较大，而采后样本的变异性相对较低。微生物相互作用网络和LEfSe分析进一步表明，采前样本中的微生物网络更为稳定。此外，与采前阶段相比，储存期间核心微生物的数量显著减少。对采后病害的调查发现，由Alternaria、Fusarium和Colletotrichum属真菌引起的腐烂是主要病害，且病害发生率与Alternaria和Colletotrichum的丰度呈正相关。同时，采后有益微生物的数量显著下降。因此，有益微生物的减少以及潜在致病真菌的增加可能在柑橘果实采后病害的发生中起着重要作用。本研究为理解潜伏感染的致病机制提供了理论基础，并为控制这些病害提供了新的视角。
引言
潜伏感染的特点是病原体在宿主体内长期存在而不引发明显疾病或大量复制。在整个潜伏期内，病原体保持休眠或静止状态，通常表现出最低的基因表达水平，以逃避宿主免疫系统的检测和清除。许多采后病害的发生都与潜伏感染直接相关。典型的例子包括柑橘和芒果的茎端腐烂、香蕉的炭疽病（Hu等人，2012年；Deng和Ceng，2008年）、仁果类水果（苹果和梨）的黑斑病和核霉病、核果类水果（桃子）的褐腐病、浆果（葡萄）的灰霉病、蜜瓜的白霉病、辣椒的果腐病以及土豆的干腐病（Adaskaveg等人，2000年；Gell等人，2008年；Yin等人，2010年）。
研究表明，潜伏性病原体通过生长期间的感染进入果实。潜伏感染的一个典型特征是病原体在进入宿主体后长时间保持不活跃状态。只有在有利条件下才会变得活跃并引发症状，最终导致病害爆发（Prusky，1996年）。例如，Diplodia属、Phomopsis mangiferae、Cytosphaera mangiferae和Pestalotiopsis属会定殖于芒果的花序组织（Johnson等人，1992年）。花序和花梗组织的内源性定殖是果实成熟过程中导致茎端腐烂的主要机制（Johnson等人，1992年）。Nair和Parker（1985年）以及Pezet等人（2003年）的观察表明，Botrytis cinerea会感染花器官和未成熟的果实，在坏死的花器官中保持半休眠状态或在葡萄发育过程中保持休眠状态。此外，B. cinerea主要存在于新鲜食用的葡萄的果柄部分，而在叶片或果实表面的存在量相对较低（Holz等人，2003年）。同时，Alternaria可以直接穿透杏子和芒果的角质层或气孔，从而在果实中潜伏（Larsen等人，1980年；Prusky，1983年）。类似地，Colletotrichum gloeosporioides会在成熟的蓝莓上形成附着物，然后进入潜伏期（Hartung，1981年）。
柑橘果实腐烂是采后运输和储存期间常见的病害，严重威胁着中国乃至全球的柑橘产业。通常腐烂率为20–30％，有时甚至高达50％，造成严重的采后经济损失（Salunkhe等人，1991年）。在柑橘类水果中，潜伏感染病害是最普遍的采后问题，包括炭疽病（Colletotrichum属）、Diplodia茎端腐烂（Lasiodiplodia theobromae）、Diaporthe茎端腐烂（Diaporthe属）和Alternaria茎端腐烂（Alternaria citri）。这些病害每年造成了相当大的采后损失。
尽管已有许多报告研究了果实上的病原体潜伏感染现象，但针对潜伏感染在宿主植物中引起的病害机制的研究仍十分有限。这一空白不利于科学地控制采后病害。为了探究潜伏感染引起的采后病害的机制，我们采用了高通量测序技术来分析柑橘果实在不同生长阶段真菌群落组成的变化，旨在分析真菌对由潜伏感染引起的柑橘果实采后病害的影响。
样本收集与DNA提取
2021年，从华中农业大学的一个果园收集了 Satsuma 柑橘（Citrus unshiu）的花和果实样本，采样时间包括：萌芽期（BP）、开花期（FP）、开花后30天（30DAF）、开花后150天（150DAF）、采收后立即（0WAH）以及采收后3周、6周和9周（3WAH、6WAH和9WAH）（图S1）。采后的果实分别包装并储存在15°C以下。同时监测了病害发生情况。
真菌群落的α多样性和β多样性分析
使用Pielou均匀度指数、Shannon多样性指数和观察到的物种丰富度进行的α多样性分析显示，萌芽期（BP）、开花后150天（150DAF）以及所有采后样本的多样性、均匀度和丰富度均显著低于开花期（FP）和开花后30天（30DAF）的样本（p < 0.05）。然而，不同采后时间点之间没有显著差异（图1A-C）。
使用主坐标分析进行的β多样性分析
讨论
柑橘的采后病害（不包括伤口感染）被归类为潜伏感染；然而，这些感染的致病机制很少被报道。在本研究中，我们对采前和采后期间收集的柑橘果实样本进行了ITS测序，并进一步调查了采后病害以进行分析。研究结果表明，不同阶段的柑橘果实中积累了不同的真菌
结论
总之，柑橘果实的采前发育阶段表现出更高的微生物多样性和更复杂、稳定的微生物网络。相比之下，采后的柑橘果实显示出较低的微生物变异性、脆弱的网络结构以及核心微生物数量的显著减少。此外，由Alternaria、Fusarium和Colletotrichum属真菌引起的果腐病是储存期间主要的采后病害。
作者声明
研究构思与设计：陈江华和傅艳萍。数据获取、分析与解释：陈江华、徐梦婷、朱婷、杨子怡、刘娟、段杰。文章起草：陈江华和傅艳萍。重要学术内容的审稿：林阳、于晓和江道红。最终批准提交版本：傅艳萍。
作者贡献声明
杨阳：验证、软件方法。 段杰：验证、调查。 刘娟：调查。 傅艳萍：撰写-审稿与编辑、撰写-初稿、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。 江道红：撰写-审稿与编辑、可视化、验证、方法学、数据管理。 于晓：验证、方法学、数据管理。 杨子怡：调查。 朱婷：调查。 徐梦婷：调查。 陈江华：利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢与资助
本工作得到了国家研发计划（2021YFD1600102）和CARS-26专项资金的支持。
