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本研究揭示载脂蛋白J (ApoJ) 是调控内皮脂肪酶 (EL) 功能的关键伴侣蛋白。通过优化EL纯化方案，作者发现ApoJ持续与EL共纯化，并通过与EL的疏水盖 (lid) 区域和色氨酸环 (tryptophan loop) 相互作用，维持EL的溶解度和磷脂酶活性。研究表明，尽管ApoJ、EL和高密度脂蛋白 (HDL) 在血浆中可共定位，但ApoJ主要通过其伴侣/脂质调节功能增强EL活性，而非将其转运至HDL。研究结果提出了一种ApoJ辅助的酶激活新模型，为理解HDL代谢和脂蛋白水解调控提供了新视角。
1. 引言
内皮脂肪酶 (Endothelial lipase, EL) 是甘油三酯脂肪酶家族中最晚被发现的成员，是血浆高密度脂蛋白 (HDL) 代谢的关键负调控因子。然而，由于活性EL纯化困难，其功能机制尚不完全明确。载脂蛋白J (Apolipoprotein J, ApoJ，又称簇集素) 是一种具有胞外伴侣功能并能与HDL结合的分泌糖蛋白。鉴于脂蛋白脂肪酶 (LPL) 和胰脂肪酶 (PL) 均已知需辅助蛋白来增强功能，且EL与LPL序列高度相似，研究人员推测EL也可能需要辅助蛋白。本研究在优化EL纯化流程中，意外发现了与EL共纯化的ApoJ，并就此展开了深入研究。
2. 结果
2.1 ApoJ与纯化的EL一同被鉴定
通过优化在哺乳动物Expi293悬浮细胞中的表达和纯化方案，研究人员首次获得了具有活性的EL蛋白。在纯化过程中，考马斯亮蓝染色凝胶在EL条带下方出现了一个未知的约75 kDa的条带。经质谱分析和蛋白质印迹验证，确定该未知条带为ApoJ。进一步的实验表明，在对照条件下（仅纯化标签）没有蛋白共纯化，证实ApoJ是特异性与EL结合的蛋白。通过小鼠血浆的尺寸排阻色谱分析，发现ApoJ、EL以及HDL的标志性载脂蛋白ApoA1在相同洗脱峰中共定位，这强有力地表明在血浆中，EL和ApoJ都存在于HDL颗粒上。
2.2 ApoJ帮助维持EL的磷脂酶活性
功能实验发现，在Expi293细胞中共过表达ApoJ与EL，可显著提高细胞培养基中EL的磷脂酶活性。这种活性增强部分归因于ApoJ共表达时，培养基中EL的浓度显著增加。反之，在稳定表达EL的HEK293细胞中使用小干扰RNA (siRNA) 敲低ApoJ，虽然EL蛋白水平无显著变化，但其磷脂酶活性显著降低。更有趣的是，即使在EL浓度一致的情况下，将纯化的脂质富集型ApoJ (lipid-rich ApoJ) 添加到反应底物中，也能显著增强EL的活性。这说明ApoJ不仅能增加EL的浓度，还能直接提升其酶活性。
2.3 ApoJ的伴侣功能保护EL及其他脂肪酶
研究人员探究了ApoJ是否通过其伴侣功能防止EL聚集。将EL与过量ApoJ共表达，并进行超速离心分离可溶与不可溶蛋白，发现过量ApoJ可显著提高EL在培养基中的溶解度。研究人员进一步测试了ApoJ对甘油三酯脂肪酶家族其他成员（LPL、HL、PL）的保护作用。结果显示，ApoJ同样能显著提高LPL和HL的溶解度，但对PL无效。序列比对分析显示，EL与LPL、HL的相似性和同一性较高，与PL则较低，这提示ApoJ对伴侣对象具有选择性。
2.4 ApoJ易于与EL相互作用，并靶向其盖区域和色氨酸环区域
为探究相互作用的分子基础，研究人员利用肽阵列技术定位了ApoJ在四种脂肪酶上的结合位点。结果显示，ApoJ与EL的相互作用最为显著，主要结合在EL的N端疏水盖 (lid) 区域和C端色氨酸环 (tryptophan loop) 区域。这两个区域对脂肪酶的催化活性和底物识别至关重要。ApoJ与LPL和HL的相同区域也有结合，但结合程度较弱。由于PL的疏水性较弱且缺乏典型的色氨酸环，ApoJ对其几乎不结合。这支持了ApoJ通过疏水区域与靶蛋白相互作用的特性。
2.5 突变EL的色氨酸环和盖区域可消除ApoJ的伴侣效应
为确认上述关键区域的重要性，研究人员构建了两种EL突变体：一是用PL的盖区域替换EL的盖区域，二是将色氨酸环中的色氨酸残基突变为亮氨酸。功能实验表明，这两种突变均完全消除了ApoJ对EL溶解度和磷脂酶活性的保护与增强作用，证实了这两个疏水区域是ApoJ发挥功能的关键位点。
2.6 纯化的ApoJ是脂质富集的蛋白复合物
研究发现，本实验中纯化的重组ApoJ天然处于脂质富集状态。质谱分析和甘油三酯定量测定显示，每个ApoJ复合物平均结合了大量脂质分子。负染透射电镜显示其平均粒径约为14.9 nm，大于预期无脂ApoJ的大小，符合脂蛋白复合物的特征。
2.7 在HDL存在下，ApoJ形成密度更大的脂质颗粒
为了解脂质富集的ApoJ是否作为载体将EL转运至HDL，研究人员进行了蔗糖密度梯度浮选实验。结果显示，单独的ApoJ或与EL混合的ApoJ倾向于漂浮到低密度蔗糖层，表明其自身可形成低密度脂质颗粒。但当HDL存在时，ApoJ在底部高密度蔗糖层的比例显著增加，表明其与HDL相互作用后形成了密度更大的复合物。
2.8 ApoJ-脂质复合物不转运EL
浮选实验还分析了EL的分布。纯化的EL主要存在于中高密度蔗糖层。当EL与HDL孵育时，其大量富集在低密度层，表明HDL可有效携带EL。然而，当EL与过量ApoJ孵育时，EL在低密度层的比例反而显著减少，说明ApoJ并非EL的有效载体。该结论在肝脏特异性ApoJ敲除小鼠血浆中得到了进一步支持：即使缺少ApoJ，EL在血浆中仍能与HDL共定位，其分布未受影响。
2.9 添加脂质富集型或脂质贫乏型ApoJ均不影响HEK293培养基中EL的聚集
研究人员比较了脂质富集型和脂质贫乏型ApoJ对EL的影响。在酶活实验中，添加脂质富集型ApoJ可增强EL对合成底物的活性，而脂质贫乏型则无此效果。然而，在敲低了内源ApoJ的细胞培养基中，无论添加哪种形式的ApoJ，均未能恢复EL的溶解度。这表明ApoJ对EL的保护可能需要在其分泌后立即发生，外源添加可能无法完全重建其功能。
2.10 Intralipid-ApoJ复合物增强EL的活性
为了在更接近天然脂蛋白的环境下验证ApoJ的作用，研究人员将脂质富集型ApoJ与脂肪乳剂Intralipid混合，构建人工脂蛋白复合物。酶活检测表明，EL对此ApoJ修饰的Intralipid的水解活性显著高于对普通Intralipid的活性。这证实了ApoJ可增强EL对类脂蛋白底物的水解能力。
基于以上结果，研究提出了“伴侣辅助的酶激活模型”：在血浆中，脂质富集的ApoJ像盾牌一样保护EL的疏水盖区域和色氨酸环，防止其聚集，维持EL处于溶解和“待命”状态。当EL遇到脂蛋白底物时，ApoJ可能通过稳定EL的盖开放构象和/或利用其色氨酸环相互作用将EL锚定在底物表面，从而增强其界面水解活性。
3. 讨论
本研究发现并证实ApoJ是EL的新型辅助蛋白和伴侣。类比于GPIHBP1之于LPL，或辅脂肪酶之于PL，ApoJ通过其伴侣和脂质调节功能，维持EL的稳定性并增强其活性，但并不负责将EL转运至其底物HDL。这一发现揭示了调控细胞外脂肪酶功能的新机制，将普遍存在的胞外伴侣ApoJ与HDL代谢的核心酶EL联系起来。对EL与ApoJ相互作用的进一步研究，将深化我们对HDL代谢、脂蛋白水解以及相关心血管疾病病理机制的理解。
