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本研究通过纵向、深度、多组学（代谢组、蛋白质组）分析，在CLN3Δex7-8小型猪模型中，系统揭示了巴藤病（CLN3病）的血液分子特征动态演变。研究鉴定了包括组织蛋白酶（CTSS/CTSB）、甘油磷酸二酯（GPDs）等在内的新型生物标志物，并构建了可准确区分患病与健康动物的复合评分（sPLS score），为理解疾病进程、开发靶向疗法及评估疗效提供了关键的转化性工具。
引言
巴藤病，又称神经元蜡样脂褐质沉积症（NCLs），是一组由13个CLN基因中任何一个发生致病性变异引起的神经退行性溶酶体贮积症。其中最常见的CLN3病，是由CLN3基因突变引起的罕见致命性常染色体隐性遗传病，患者通常在儿童早期出现视力丧失，随后发生癫痫、运动和认知能力下降，并在三十岁前夭折。尽管已有多年研究，但CLN3蛋白的分子功能仍未完全阐明，且该领域仍然缺乏能够全面反映疾病状态的稳健生物标志物特征。随着越来越多的CLN3病特异性疗法进入临床试验，对能够追踪疾病进展和治疗效果的非侵入性生物标志物的需求日益迫切。本研究旨在通过无靶向代谢组学和深度纳米颗粒蛋白质组学方法，利用携带最常见患者突变（第7和第8外显子约1 kb缺失）的CLN3Δex7-8尤卡坦小型猪模型，揭示更多样化的CLN3病相关生物标志物，并深入了解CLN3的分子功能。
方法
研究采集了CLN3Δex7-8突变型和野生型对照小型猪在疾病不同阶段（6月龄：症状前；24月龄：中期/症状期；36月龄：晚期）的血清样本。通过全面的质谱分析（包括代谢物和脂质）进行代谢组学检测。同时，利用Seer公司的纳米颗粒（ProteographTM）技术结合TMTpro 18-plex标记，进行了深度蛋白质组学分析。数据处理后，共获得了769种代谢物和2634种蛋白质的相对定量数据，构成了迄今为止在猪血清上最详尽的多组学图谱。统计分析采用双尾学生t检验等方法，并通过多模块稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）构建了综合生物标志物评分模型。
结果
研究表明，在CLN3Δex7-8小型猪血清中，分子景观随着疾病进展而发生动态变化。在症状前（6月龄）阶段，疾病状态的特征是甘油磷酸二酯（GPD）物种和溶酶体蛋白酶的升高。其中，组织蛋白酶S（CTSS）和组织蛋白酶B（CTSB）是在所有时间点差异表达最显著的两种蛋白质，呈现稳定且显著的纵向升高模式。此外，干扰素-γ诱导的溶酶体硫氧还蛋白还原酶（IFI30）以及心肌富集蛋白肌球蛋白调节轻链2（MYL2）、肌球蛋白-7（MYH7）也在多个时间点显著升高。而神经丝轻链（NFL）仅在36月龄晚期才显示出显著差异。
在代谢物方面，一组结构相似的甘油磷酸二酯，特别是甘油磷酸肌醇（GPI）和甘油磷酸乙醇胺（GPE），在所有时间点均呈现最显著且一致的上升，这与先前研究一致。研究还发现，在疾病晚期（36月龄），与免疫细胞激活和鞘脂代谢相关的物种显著富集。网络分析揭示了涉及鞘脂代谢、甘油磷脂代谢和糖鞘脂生物合成的蛋白质与代谢物发生了显著变化，例如乳糖基神经酰胺、鞘氨醇、鞘磷脂等代谢物水平升高。
为整合复杂的多组学数据，研究构建了一个基于多模块sPLS-DA的疾病评分（sPLS score）模型。该模型最终选取了两个蛋白质（CTSS, CTSB）和两个代谢物（GPI, GPE）作为核心变量。由此生成的复合评分在训练集和独立的测试集中均能完美区分患病与健康动物，其区分能力优于任何单个生物标志物。
讨论
本研究通过纵向深度多组学分析，成功描绘了CLN3疾病进展的分子时间线。早期持续升高的甘油磷酸二酯可能与CLN3功能丧失有直接关联，或是早期溶酶体贮积底物。而晚期出现的鞘脂代谢紊乱，则可能代表了继发的病理过程。稳定高表达的溶酶体蛋白酶（CTSS, CTSB）可能反映了溶酶体质量增加或转录因子EB（TFEB）激活导致的代偿性上调。心肌蛋白标志物的升高提示该大型动物模型可能存在心脏受累表型，值得进一步探究。
本研究采用的物种无关的纳米颗粒蛋白质组学工作流程，有效克服了血液蛋白质动态范围宽的挑战，实现了对猪血清深度、无偏的蛋白质组覆盖。这项技术的应用使得在缺乏特异性耗竭试剂的模型生物中开展大规模深度蛋白质组学研究成为可能。
结论
这项工作展示了深度多组学分析在揭示复杂退行性疾病特异性生物标志物方面的强大能力。研究不仅鉴定出CTSS、CTSB、GPI、GPE等具有转化潜力的新型血液生物标志物，还通过构建复合生物标志物评分，为临床提供了一个有望用于疾病诊断、分期和治疗效果评估的实用工具。这些发现为理解CLN3病的发病机制、病理生理过程以及未来开发靶向治疗策略提供了宝贵的见解和数据基础。
