《Italian Journal of Animal Science》：Effects of feeding biochar on the faecal bacterial community in horses
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这篇研究评估了在马日粮中添加1%生物炭对粪便细菌群落的影响。通过交叉试验和高通量16S rRNA测序分析，研究发现添加生物炭对马粪便细菌的α多样性和β多样性均无显著影响，且主要细菌门（如Firmicutes、Bacteroidota）和科（如Lachnospiraceae、Ruminococcaceae）的相对丰度也未发生显著变化。该研究结论指出，在实际应用添加水平下，这种高温处理的软木生物炭对马的肠道微生物组调节潜力有限。
引言
胃肠道疾病是马匹死亡的主要原因，这使得肠道健康成为马匹管理中的关键问题。马匹胃肠道内存在着复杂且动态的微生物群落，在营养消化、免疫功能及整体健康维持中起着至关重要的作用。然而，该微生物群落对包括日粮组成在内的多种内外因素敏感。肠道微生物群失调与严重的健康问题相关。因此，旨在稳定或调节胃肠道微生物群以改善马匹肠道健康的策略受到越来越多的关注。
一种策略涉及使用生物炭。生物炭是一种在生物能源生产过程中通过生物质热解产生的富碳材料，因其高孔隙结构、大比表面积和参与氧化还原相互作用的能力，可以为微生物定植创造有利环境。这些特性可能支持有益的微生物群落，并提高胃肠道内的发酵效率，使生物炭成为一种有前景的功能性饲料添加剂。
多项研究已探讨生物炭对动物肠道微生物组的影响，但结果因动物种类、生物炭类型和剂量而异。在马匹中，先前的一项体外孵育研究发现活性炭（一种功能上与生物炭相似的材料）对细菌群落没有影响。在反刍动物中，研究表明生物炭对瘤胃微生物多样性影响甚微，但具有增加某些细菌科丰度的潜力。然而，截至目前，尚无研究评估生物炭对马匹肠道微生物组的体内影响。
本研究的主要目标是评估日粮中添加生物炭对马匹粪便微生物组的影响。研究假设饲喂生物炭会对整体细菌群落结构产生边际效应，但会增加有益细菌类群的丰度，同时减少不良细菌类群。
材料与方法
本研究在捷克共和国动物科学研究所的实验农场进行，重点评估了同一干预措施对粪便微生物群的影响。所用生物炭由云杉木通过多级双火气化炉制备，具有高碳含量、高pH值、大比表面积和高孔隙度的特性。实验采用交叉设计，使用了八匹成年温血马，分为两个15天的周期。马匹接受两种日粮处理：对照日粮（由草甸干草和压碎大麦组成）和实验日粮（在对照日粮基础上补充生物炭，添加量为日粮干物质的1%）。在每期实验的第12和13天，采集粪便样本用于细菌群落组成分析。使用商业试剂盒提取粪便样本DNA，并采用特异性引物对16S rRNA基因的V4区域进行PCR扩增，随后在Illumina MiniSeq平台上进行测序。所得序列使用DADA2流程和SILVA数据库进行分析。统计方面，使用线性混合模型分析处理对α多样性的影响，并使用PERMANOVA和Bray-Curtis相异性评估β多样性。
结果
测序共获得高质量序列1,307,893条，对应所有样本中的4,830个独特扩增子序列变异体。
生物炭补充对α多样性（香农指数：对照8.2，生物炭8.0；p=0.298）或β多样性（p=0.248）均无影响。非度量多维标度图显示，无论处理如何，来自同一个体的样本紧密聚集，表明个体身份是微生物群落变异的主要来源。
在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）占主导地位，其相对丰度在处理间无显著变化。厚壁菌门与拟杆菌门的比率也未显示统计学差异。其他主要的门包括疣微菌门、纤维杆菌门和螺旋体门。
在科水平上，丰度排名前十的科包括毛螺菌科、链球菌科、未分类细菌、p-251-o5、颤螺菌科、理研菌科、普雷沃氏菌科、纤维杆菌科、螺旋体科和瘤胃球菌科。包括毛螺菌科和瘤胃球菌科在内的所有主要细菌科的相对丰度在处理间均无统计学显著差异。
讨论
肠道微生物组对维持马的肠道完整性和整体健康至关重要。然而，本研究表明，在测试条件下，补充生物炭对马粪便细菌的影响微乎其微，表明其微生物组调节潜力有限。
具体而言，生物炭补充对马粪便细菌群落的α或β多样性没有显著影响。这一发现与早期的马匹体外研究结果一致。其他物种的研究结果则存在差异，这可能归因于生物炭类型、给药方式、评估部位以及剂量的不同。研究结果暗示，生物炭可能在远高于马匹实用水平的剂量下才具有调节细菌群落结构的潜力。
与先前报道一致，马粪便微生物组以厚壁菌门和拟杆菌门为主。厚壁菌门/拟杆菌门比率被提议作为马肠道菌群失调的潜在标志物。在本研究中，该比率在对照组为1.85，在生物炭组为1.68，表明生物炭对肠道菌群可能具有轻微的归一化效应，但差异不显著。生物炭补充并未显著影响任何主要细菌门的相对丰度，这与同一实验中挥发性脂肪酸和氨氮等关键发酵产物未发生变化的早期观察结果一致，进一步支持生物炭在广泛分类学水平上不改变后肠微生物功能的观点。
先前同一实验的结果显示，饲喂生物炭的马匹粪便pH值高于对照组。基于此，预期微生物群落会相应变化，有利于纤维降解细菌，而不利于耐酸类群。然而，生物炭补充后pH值升高并未影响纤维降解细菌的相对丰度，这可能归因于pH值增幅相对较小，且对照组粪便pH值已高于纤维降解活动的最佳下限。同样，预期的链球菌科和乳杆菌科减少也未观察到。这些类群以其耐酸性和在淀粉诱导的酸中毒中产生乳酸而闻名。由于基础日粮一致，可溶性碳水化合物的可用性可能维持了其种群。生物炭诱导的粪便pH值适度升高不足以改变耐酸类群和纤维降解类群之间的竞争平衡。粪便pH值效应与细菌类群丰度缺乏效应之间的差异表明，生物炭主要通过物理而非抗菌机制起作用。总体而言，没有一个细菌科受到生物炭补充的显著影响。这与反刍动物中的几项研究结果形成对比，后者发现生物炭补充增加了关键细菌科的丰度。这种不一致可能源于生物炭类型和/或添加水平的差异。然而，影响微生物反应的最重要因素可能是消化道内的发酵部位。与反刍动物不同，马是后肠发酵动物，其盲肠和结肠具有扩大的发酵室。在到达这些部位之前，生物炭沿着胃肠道经历生物和非生物相互作用，并暴露于从酸性到碱性的可变pH环境中。尽管其碳骨架在通过肠道时似乎结构稳定，但生物炭可以吸附有机和矿物化合物。因此，其微生物和发酵效应在后肠发酵动物和前肠发酵动物之间可能存在显著差异。
生物炭对肠道微生物组的影响通常被认为是间接的，由理化环境的改变介导，而非直接的抗菌活性。提出的机制包括为微生物附着和生物膜形成提供表面、吸附抑制性化合物以及调节局部pH值和电导率，这些共同可能影响微生物活性和群落组成。本研究中高温生物炭的微弱效应可能与其相对惰性有关。高温生物炭失去了大部分含氧官能团，这些官能团对表面电荷、阳离子交换和吸附很重要。此外，随着热解温度升高，生物炭碳变得更加顽固，减少了控制微生物相互作用和定植的不稳定碳的可用性。
本研究结果需谨慎解读，因为存在一些局限性。首先，微生物组分析方法存在固有局限性：DNA测序捕获的是相对丰度，而非总细菌负荷。这一局限性部分通过对细菌产物的分析得到弥补，后者未提示细菌负荷发生变化。其次，未分类科的比例相对较高，这可能反映了16S rRNA基因测序在较低分类水平上解析类群的能力有限，特别是在马后肠中，当前参考数据库中仍有大量微生物群落未被充分代表。第三，仅分析了粪便微生物组，这可能反映的是远端后肠的情况，无法准确代表更近端区域（如盲肠）的微生物群落。最后，本研究使用的动物数量相对较少。然而，交叉设计的使用使每只动物都能作为自身的对照，从而减少了受试者间的变异性并增加了统计效力。
结论
以日粮干物质1%的比例补充生物炭对马粪便中的细菌多样性以及主要细菌类群的相对丰度影响可忽略不计。相应地，未观察到有益细菌类群的明显选择性富集或不良类群的抑制。总体而言，结果表明这种高温软木生物炭在肠道环境中具有微生物学惰性，不具备作为调节马肠道微生物组的饲料补充剂的潜力。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者Joch M.处获取。
