Fstl1靶向siRNA的PLGA纳米递送系统在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化中的治疗作用探究

《Experimental Lung Research》：Targeted delivery of Follistatin-like 1 siRNA via biodegradable nanoparticles attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice

本研究聚焦于治疗特发性肺纤维化(IPF)这一致死性慢性肺病，提出了一种创新性的纳米药物策略。通过筛选出能有效敲低Fstl1基因的小干扰RNA(si-Fstl1-12)，并将其负载于生物可降解的PLGA纳米粒中，构建了PLGA-si-Fstl1-12递送系统。体内实验表明，经鼻给药该系统可显著降低肺组织Fstl1表达，有效减轻博来霉素诱导的间质性纤维化和胶原沉积，为IPF的靶向治疗提供了新思路。

　　

背景

特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性、进行性、病因不明的间质性肺病，其特征是成纤维细胞异常增殖和细胞外基质(ECM)过度沉积，最终导致呼吸衰竭，目前缺乏有效的治疗策略。转化生长因子β1(TGF-β1)是纤维化疾病发病和进展的核心，而卵泡抑素样蛋白1(Fstl1)是一种由TGF-β1调控的分泌型糖蛋白，在IPF患者和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中表达均显著上调，被认为是潜在的治疗靶点。小干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰(RNAi)能够特异性沉默靶基因表达，但其在体内的应用面临易降解、细胞摄取难等挑战。聚(D,L-乳酸-羟基乙酸)(PLGA)是一种美国食品药品监督管理局(FDA)批准的可生物降解、生物相容性良好的共聚物，有望作为siRNA递送载体。

材料与方法

本研究设计并筛选了四种靶向Fstl1的siRNA序列，在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中评估其敲低效率，其中si-Fstl1-12展现出约80%的最高敲低效率，并能显著抑制TGF-β1诱导的Fstl1和ECM蛋白(如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原)的上调。通过将si-Fstl1-12装载入PLGA纳米粒，构建了PLGA-si-Fstl1-12递送系统。随后，在博来霉素诱导的C57BL/6J小鼠肺纤维化模型中，经鼻给予PLGA-si-Fstl1-12，通过qRT-PCR、蛋白质印迹法(Western blot)分析Fstl1表达，并通过苏木精-伊红(H&E)染色、Masson三色染色、肺纤维化评分和羟脯氨酸含量测定评估纤维化程度和胶原沉积。

结果

1. 1.
   si-Fstl1-12在体外抑制TGF-β1诱导的Fstl1表达：在MEFs中，si-Fstl1-12可显著抑制TGF-β1诱导的Fstl1mRNA和蛋白表达。Western blot结果进一步证实，Fstl1的敲低能明显抑制TGF-β1诱导的α-SMA和I型胶原蛋白的产生，表明其能够抑制TGF-β1介导的成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。
2. 2.
   si-Fstl1-12在体内减弱博来霉素诱导的Fstl1表达：在博来霉素处理的小鼠中，经鼻给予si-Fstl1-12有效地降低了肺组织中Fstl1的mRNA和蛋白水平，并减轻了因博来霉素处理导致的体重下降。
3. 3.
   si-Fstl1-12在体内减轻肺纤维化：组织学评估显示，si-Fstl1-12处理显著减轻了博来霉素诱导的肺间质纤维化。肺纤维化评分和羟脯氨酸含量测定结果均表明，si-Fstl1-12治疗组的胶原沉积显著低于对照组。Masson染色和Western blot分析也一致显示，I型胶原的表达和积累在si-Fstl1-12治疗后明显减少。
4. 4.
   PLGA-si-Fstl1-12纳米粒的表征和体外转染：成功构建的PLGA-si-Fstl1-12纳米粒平均直径为340纳米。细胞毒性实验显示，即使在高浓度下，其对293T细胞的存活率也超过90%，显示出良好的生物相容性。在A549细胞中，PLGA-siRNA纳米粒能有效抑制报告基因GFP的表达，证实了其体外基因沉默效率。
5. 5.
   PLGA-si-Fstl1-12纳米粒在体内减轻肺纤维化：在博来霉素处理的小鼠模型中，经鼻给予PLGA-si-Fstl1-12纳米粒同样有效地降低了肺组织中Fstl1的表达。组织病理学检查、纤维化评分和羟脯氨酸含量分析均证实，PLGA-si-Fstl1-12治疗显著减轻了博来霉素诱导的肺纤维化和胶原沉积。

讨论

本研究首次在体内证实，靶向Fstl1的siRNA能有效缓解肺纤维化。Fstl1在肺损伤反应中上调，促进肌成纤维细胞扩增和纤维化发展，是治疗进行性肺纤维化的一个有前景的靶点。利用RNAi技术沉默Fstl1表达具有治疗潜力，但其应用瓶颈在于体内有效递送。本研究采用的PLGA纳米递送系统，不仅能保护siRNA免于被核酸酶降解，增强其在体内的稳定性，其缓释特性还有助于在靶组织中维持治疗性siRNA浓度。研究结果表明，PLGA-si-Fstl1-12纳米粒可有效降低肺组织Fstl1表达，并显著减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。尽管本研究未涵盖PLGA-si-Fstl1-12纳米粒的药代动力学、生物分布和系统毒性分析，但结果为基于siRNA的纳米药物治疗肺纤维化提供了概念验证。

结论

本研究揭示了Fstl1在肺纤维化治疗中以前未被充分认识的作用。研究表明，通过siRNA介导的Fstl1基因沉默，可有效减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。这些发现凸显了Fstl1作为一个有潜力的治疗靶点，并提示基于siRNA的Fstl1抑制策略，特别是借助生物相容性良好的PLGA纳米递送系统，可能成为肺纤维化一种安全有效的治疗选择，为开发新的RNA纳米药物治疗纤维性肺病奠定了基础。