《Research》：PGK1 Lactylation-Driven Self-Reinforcing Loop Orchestrates Glycolytic Reprogramming in FSP1+ Macrophages in Liver Fibrosis
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为解决肝纤维化治疗靶点有限的问题，研究人员聚焦FSP1+巨噬细胞，揭示了其通过FSP1-PKM2相互作用促进糖酵解及乳酸生成，进而驱动PGK1 K353乳酸化修饰，形成糖酵解/PGK1乳酸化正反馈环路，从而维持促纤维化微环境的全新机制。针对PGK1-K353la的靶向肽抑制剂K353-pe在临床前模型中显示出显著疗效，为肝纤维化治疗提供了新策略。
肝纤维化，特别是进展至终末期时，长期以来被认为难以治愈，肝移植是唯一根治性选择。这一动态病理级联反应主要由持续过度活化的肝脏炎症驱动。在这一过程中，免疫细胞，尤其是被募集的巨噬细胞，被认为是肝纤维化进展或消退的关键调控者。然而，关于驱动巨噬细胞促纤维化功能的精确分子机制和信号网络，仍存在关键的知识空白。代谢重编程，特别是糖酵解增强，是巨噬细胞经典活化（M1型）的关键特征。这一过程不可避免地导致乳酸等代谢终产物的积累。传统上被视为无氧葡萄糖代谢废弃物的乳酸，近年来被发现可作为信号分子、能量底物和免疫调节因子发挥多方面的作用。乳酸驱动的乳酸化修饰作为一种新兴的翻译后修饰，与炎症、神经发育和肿瘤发生相关，可能在肝纤维化中充当代谢重编程和基因失调之间的桥梁。然而，肝纤维化中的乳酸化修饰景观仍未被充分阐明，其在纤维化起始和进展中的确切作用在很大程度上是未知的。揭示这些机制对于开发针对纤维化的靶向疗法至关重要。
研究人员首先通过对公共数据库和临床样本的分析，锁定了一个在纤维化肝脏中显著扩增的致病性FSP1+（成纤维细胞特异性蛋白1）巨噬细胞亚群。他们利用髓系特异性Fsp1基因敲除（LysMcreFsp1f/f）小鼠模型，结合多种肝纤维化诱导模型，证实了FSP1+巨噬细胞是驱动肝纤维化进展的关键治疗靶点。机制上，他们发现FSP1能够与糖酵解关键限速酶PKM2（丙酮酸激酶M2）发生物理相互作用，抑制其泛素-蛋白酶体途径降解，从而稳定PKM2蛋白。这种相互作用增强了巨噬细胞的糖酵解通量和乳酸生成，进而促进了赖氨酸乙酰转移酶2B（KAT2B）介导的磷酸甘油酸激酶1（PGK1）在赖氨酸353位点（K353）的乳酸化修饰。这一翻译后修饰形成了一个强大的正反馈环路：一方面，PGK1的K353乳酸化增强了其自身的酶活性和向线粒体的转位，活化了线粒体中的丙酮酸脱氢酶激酶1（PDHK1），从而抑制了线粒体的丙酮酸代谢，进一步放大了糖酵解；另一方面，增强的糖酵解又会产生更多乳酸，为PGK1的进一步乳酸化提供底物。这个“糖酵解/PGK1乳酸化”自我强化环路将巨噬细胞锁定在促炎、促纤维化的M1表型。基于此发现，研究人员设计了一种靶向PGK1-K353乳酸化位点的细胞穿膜肽抑制剂（K353-pe），并在细胞、动物模型和模拟人体肝脏微环境的3D（三维）肝脏纤维化球体模型中验证了其有效缓解肝纤维化进展的潜力。这项工作发表在《Research》期刊上，为理解肝纤维化中免疫代谢调控提供了新见解，并提出了一个前景广阔的治疗新靶点。
为开展研究，作者综合运用了多种关键技术。在样本来源上，研究使用了24例肝硬化患者和12例对照者（血管瘤手术边缘）的肝脏样本，以及多种（CCl4、MCD饮食、BDL）诱导的小鼠肝纤维化模型。关键方法包括：生物信息学分析（整合GEO、STRING等公共数据库，及单细胞RNA测序数据）；基因编辑与功能验证（构建髓系特异性Fsp1敲除小鼠，通过siRNA、过表达、Co-IP、流式细胞术等技术验证FSP1功能）；多组学与代谢分析（进行蛋白质组学、RNA测序、靶向代谢组学，并使用Seahorse分析细胞能量代谢）；翻译后修饰检测（利用免疫沉淀结合质谱法大规模鉴定乳酸化修饰蛋白，并开发了PGK1-K353la特异性抗体）；结构模拟与分子动力学（模拟FSP1-PKM2/PGK1的相互作用）；以及治疗策略开发与验证（设计并合成靶向肽K353-pe，在体外、体内及3D肝脏球体模型中进行疗效评估）。
研究结果
FSP1在巨噬细胞中表达上调并驱动肝纤维化中的促炎反应
对公共数据库和临床样本的分析显示，FSP1在多种病因导致的肝纤维化中表达上调，且与纤维化严重程度呈正相关。免疫荧光染色证实FSP1主要定位于肝脏巨噬细胞。构建髓系特异性Fsp1敲除（LysMcreFsp1f/f）小鼠，并在三种纤维化模型（CCl4、MCD饮食、BDL）中进行验证。结果显示，敲除FSP1显著减轻了肝脏胶原沉积、炎症细胞（如Ly6G+中性粒细胞）浸润，降低了促炎因子（TNF-α, IL-1β）水平，同时增加了抗炎因子IL-10。体外实验表明，FSP1缺陷的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）M1极化能力减弱，与肝星状细胞（HSCs）共培养时激活HSC的能力下降。结论：FSP1+巨噬细胞是驱动肝纤维化炎症和纤维化进展的关键细胞亚群。
FSP1通过与PKM2相互作用并增强其稳定性来促进巨噬细胞的糖酵解
对Fsp1敲除小鼠的蛋白质组学和RNA测序分析均显示糖酵解通路显著富集。在纤维化肝脏和M1极化的巨噬细胞中，关键糖酵解酶（HK2, PKM2, PFK1）表达、乳酸生成和LDH活性均升高，而在Fsp1敲除后这些现象被逆转。Seahorse能量代谢分析证实FSP1缺失削弱了M1巨噬细胞的糖酵解转换。机制上，通过免疫共沉淀、免疫荧光和分子动力学模拟，证实FSP1与PKM2直接结合，其结合界面位于PKM2的A1和A2结构域。FSP1不改变PKM2的mRNA水平，但能抑制其泛素化，从而稳定PKM2蛋白，防止其被蛋白酶体降解。结论：FSP1通过稳定PKM2来增强巨噬细胞的糖酵解。
FSP1诱导的乳酸积累通过KAT2B乳酸转移酶驱动PGK1在K353位点的乳酸化
在肝硬化患者血清中，乳酸水平与纤维化严重程度正相关。FSP1敲除降低了纤维化肝脏和M1巨噬细胞中的整体蛋白乳酸化水平。通过免疫沉淀结合质谱技术，研究人员在纤维化肝脏中鉴定出549个差异乳酸化蛋白，其中103个在FSP1敲除后乳酸化降低，糖酵解通路被显著富集。PGK1被确定为关键乳酸化底物。乳酸补充可增强PGK1乳酸化，而抑制乳酸输出或生成则降低之。质谱鉴定和点突变（K353R）证实K353是PGK1的主要乳酸化位点。通过筛选，研究人员发现乙酰转移酶KAT2B（又称PCAF）是催化PGK1 K353乳酸化的“书写酶”，而sirtuin家族成员（如SIRT7）可能是潜在的“擦除酶”。结论：FSP1通过增强糖酵解导致乳酸积累，进而通过KAT2B驱动PGK1在K353位点的特异性乳酸化。
糖酵解/PGK1乳酸化在FSP1+巨噬细胞中形成正反馈环路
功能研究发现，PGK1的K353乳酸化增强了其糖酵解酶活性。更重要的是，乳酸化促进了PGK1向线粒体的转位及其与PDHK1的相互作用。在线粒体中，活化的PGK1磷酸化并激活PDHK1，后者进一步磷酸化并抑制丙酮酸脱氢酶（PDH），从而阻断线粒体丙酮酸代谢，迫使细胞更依赖糖酵解。分子动力学模拟表明，K353乳酸化通过引起构象变化，增加了PGK1第203位丝氨酸（S203）的暴露，可能促进其磷酸化，而S203磷酸化是已知的线粒体转位信号。PGK1 K353R突变体则无法形成此环路，并导致代谢向氧化磷酸化偏移。结论：PGK1 K353乳酸化形成了一个自我强化的正反馈环路，将巨噬细胞锁定在糖酵解优势的促纤维化状态。
靶向PGK1-K353乳酸化可缓解肝纤维化
临床样本分析显示，PGK1-K353la在肝硬化组织中特异性高表达，且与纤维化标志物（α-SMA, Collagen I）正相关，提示其作为生物标志物和治疗靶点的潜力。使用广谱PGK1抑制剂NG52在体内外均能减轻纤维化。为了更精准干预，研究人员设计并合成了一个靶向PGK1-K353乳酸化位点的细胞穿膜肽（K353-pe）。体外实验证明，K353-pe能特异性抑制PGK1乳酸化，阻断其线粒体转位和PDHK1/PDH通路激活，抑制M1极化，并将细胞代谢从糖酵解重编程回氧化磷酸化。在三种小鼠肝纤维化模型中，K353-pe治疗能显著降低肝脏PGK1乳酸化、乳酸水平、炎症和胶原沉积，且无明显毒性。在模拟人体肝脏的3D纤维化球体模型中，K353-pe同样有效抑制了胶原沉积和HSC活化。结论：特异性靶向PGK1-K353乳酸化是治疗肝纤维化的有效策略。
研究结论与意义
本研究揭示了一个由FSP1+巨噬细胞驱动的、通过“糖酵解-PGK1乳酸化”自我强化环路促进肝纤维化进展的全新机制。FSP1通过稳定PKM2增强糖酵解和乳酸生成，乳酸进而通过KAT2B介导PGK1在K353位点的乳酸化修饰。乳酸化的PGK1功能增强并向线粒体转位，激活PDHK1以抑制线粒体代谢，从而进一步放大糖酵解，形成一个锁定促纤维化表型的正反馈轴。这一发现将免疫细胞的代谢重编程、乳酸化修饰和线粒体功能失调有机联系起来，深化了对慢性肝病中免疫代谢串扰的理解。重要的是，研究不仅阐明了机制，还成功转化了发现：针对关键节点PGK1-K353la设计的靶向肽K353-pe，在临床前模型中展现出良好的治疗前景。这项工作确立了PGK1 K353乳酸化作为肝纤维化中巨噬细胞代谢重编程和炎症极化的核心调控点，不仅为其作为疾病分期和预后的生物标志物提供了依据，更重要的是为肝纤维化这一临床需求迫切的领域，提供了一种基于精准靶向翻译后修饰的新型治疗策略。
