利用O-PTIR和稳定同位素探针技术研究雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）中光调控的增殖和分裂过程

《Algal Research》：Investigation of light-regulated proliferation and division in Haematococcus pluvialis using O-PTIR and stable isotope probing

解析不同光质对雨生红球藻碳代谢流向及细胞分裂的影响，结合O-PTIR显微光谱与稳定同位素探针技术，发现红光促进蛋白质合成，蓝光诱导脂质积累，细胞分裂中期代谢活性最高。

　　

张帅|穆斯塔法·古达|雷嘉月|董玉伦|张海亮|詹白韶|何勇|李晓丽

浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州，310058，中国

摘要

关于光照生理条件下碳分配给蛋白质和脂质的分子基础仍然知之甚少，尤其是在Haematococcus pluvialis的生长和代谢过程中。因此，本研究旨在阐明不同光谱对H. pluvialis碳流的影响，从而建立一个将光感知与细胞分裂联系起来的框架。我们开发了一种综合方法论，结合了稳定同位素探针（使用NaH¹³CO?）和高分辨率光热红外（O-PTIR）显微光谱技术，来追踪在红光、蓝光和白光下新合成生物分子中的¹³C掺入情况。结果表明，红光诱导了明显的光谱红移（Δν?=?8–10?cm^?1，位于1665?cm^?1），这与酰胺I的振动有关，表明蛋白质生物合成增强。相反，蓝光导致蛋白质水平从25.1?±?0.5%下降到21.3?±?0.4%，而脂质则从15.2?±?0.3%显著上升至17.9?±?0.2%，揭示了一个“应激诱导”的脂质储存阶段。O-PTIR成像显示脂质分布在膜和液滴中，而蛋白质均匀分布，反映了它们的功能区室。分裂中期显示出最高的生物分子活性，蛋白质强度（602?a.u.）几乎是分裂前细胞的两倍。总之，本研究将O-PTIR与同位素追踪技术结合，成为理解单细胞水平上碳流动和分子重塑的强大工具，有助于提高藻类生物量和高价值代谢产物的生产。

引言

Haematococcus pluvialis是一种单细胞绿藻，由于其能够积累高水平的虾青素而具有重要的科学和商业价值，虾青素是一种酮类类胡萝卜素，以其卓越的抗氧化活性和在营养保健品、化妆品、制药和水产养殖中的广泛应用潜力而闻名[1]，[2]。除了作为“虾青素工厂”的经济价值外，H. pluvialis还是研究微藻细胞周期、增殖、分化和代谢调控的理想单细胞模型生物。其明确的生命周期（从运动性双鞭毛细胞转变为非运动性囊泡）、独特的形态变化以及对光和营养等环境因素的高敏感性使其特别适合此类研究[3]。在大规模微藻培养中，光是影响生长、分裂和代谢产物合成的最关键环境因素之一。

在各种环境信号中，光被认为是一个关键因素，它既作为能量来源，也作为调节信号，影响光合作用效率和细胞分化。尽管光强度和光周期已经得到了充分研究，但光的质量，特别是其光谱组成，在藻类生长和代谢产物形成中的作用仍不够清楚[4]。不同的波长会选择性地激活光受体，如光敏色素（红/远红光）和隐花色素或光向性蛋白（蓝光），从而引发下游信号级联，控制光合作用、碳分配和应激反应。红光通常与叶绿素合成和生物量积累增强相关，而蓝光则常常触发细胞应激途径，促进次级代谢产物的产生，包括脂质和类胡萝卜素[5]。这些依赖于波长的调节代表了微藻在波动光照环境中优化资源利用和代谢平衡的内在生存策略。

尽管人们对这一领域的兴趣日益增加，但对于光谱如何协调H. pluvialis的亚细胞碳分配和驱动代谢重编程的机制仍了解有限。传统的批量分析方法（如光密度测量、色谱法或荧光染色）提供了有价值的生化见解，但无法捕捉单细胞的异质性或分子变化的空间动态[6]。荧光标记技术虽然提供了信息，但可能会干扰正常的生理过程，并且不能在变化的光条件下连续监测活细胞。需要一种无标记、非破坏性的、高分辨率的方法，能够实时可视化和量化细胞内过程，以阐明光如何影响藻类代谢。

传统的微藻生长分析方法，如光密度测量和流式细胞术，可以提供细胞密度和生物量等一般参数[7]，[8]。然而，它们缺乏将细胞代谢状态相关联所需的特异性。通过色谱技术进行的代谢产物分析可以准确量化生化分子，但具有破坏性，并且受到群体平均值的影响，忽略了细胞间的异质性[9]。虽然活细胞荧光染色可以可视化细胞成分，但其潜在的细胞毒性限制了其长期使用。最近，已经开发出了无标记成像技术，如共聚焦拉曼和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜[10]。然而，在信号强度和空间分辨率方面仍存在挑战，这突显了需要一种新型的非破坏性技术来进行原位高分辨率化学成像[11]。

光热红外（O-PTIR）光谱技术的出现为解决这些挑战提供了强大的工具。O-PTIR是一种新颖的振动成像技术，能够检测样品中脉冲红外光吸收引起的瞬态光热效应，其空间分辨率为500?nm。这超过了传统FTIR显微镜的衍射极限，接近光学显微镜的分辨率[12]，[13]，[14]。该技术具有几个显著优势：首先，它是无标记的，可以直接从生物分子（如蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物）的内在化学键振动中提供特定的“指纹”信息[15]。这些特性使O-PTIR在生物医学研究和单细胞分析中极具前景[16]。

然而，将这种技术应用于研究在光质调节下的微藻动态增殖仍大部分未被探索。为了进一步追踪新形成代谢产物的流动并阐明在特定光条件下的碳同化产物的命运，稳定同位素探针（SIP）提供了一种有效的方法。例如，用¹³C标记的碳源（如¹³CO?或¹³C-葡萄糖）喂养微藻，会导致¹³C掺入新合成的生物大分子（脂质、蛋白质、多糖）中。由于¹²C和¹³C-¹²C/¹³C–¹³C键的振动频率显著不同，这种“重同位素”的掺入在O-PTIR和拉曼光谱中会引起明显的峰位移（光谱位移），从而提供了一种内在的、无标记的化学标记，用于区分“新合成”的和“预先存在的”分子[17]。先前的研究已经成功地使用拉曼光谱观察到¹³C在微藻细胞中掺入虾青素，以及¹⁵N掺入鸟嘌呤[18]，[19]。因此，将O-PTIR的高空间分辨率化学成像能力与SIP的代谢流追踪能力相结合，将使我们能够以前所未有的独特视角“看到”并量化不同光质如何在单细胞甚至亚细胞水平上引导碳流向特定的代谢途径和细胞区室[20]。

在这项研究中，我们应用O-PTIR光谱技术结合稳定同位素探针，来阐明不同光质如何调节H. pluvialis的增殖、分裂和细胞内碳分配。通过将光谱特征与生化测定和化学计量建模相结合，我们旨在阐明在红光和蓝光条件下蛋白质和脂质合成之间重新分配碳的代谢“切换”。这种机制理解为大规模微藻培养中的精确光管理奠定了基础，最终促进了高价值生物产品的可持续生产。

实验部分

微藻培养

H. pluvialis（绿藻门，菌株编号FACHB-827）来自中国科学院的淡水藻类培养库（湖北省武汉），使用BG11培养基（Macklin，B775903，上海）进行培养，该培养基主要含有柠檬酸、柠檬酸铁铵、EDTA二钠和碳酸钠。培养过程在9:00至21:00期间遮光，21:00至9:00期间使用定制的LED白光、红光和蓝光（6000勒克斯），保持12:12小时的光暗周期

结果与讨论

为了揭示光质如何控制H. pluvialis的代谢分配和细胞重塑，我们建立了一个多尺度分析框架，将稳定同位素追踪与O-PTIR显微光谱和生化定量相结合。这种综合方法使得生物分子转化的可视化和量化达到了前所未有的空间和代谢分辨率[16]。在第2天、第5天和第7天进行采样，以捕捉不同的生理阶段

结论

本研究强调了光质在控制H. pluvialis细胞代谢和分裂中的关键作用。通过使用O-PTIR和同位素探针，有效地追踪了¹³C在细胞中的掺入情况。结合生化数据和O-PTIR的PLS模型揭示了一个“代谢切换”模型。蛋白质峰的红移表明了代谢活动，表明红光有利于蛋白质合成，促进细胞生长，并抑制脂质积累。相反，蓝光则诱导

CRediT作者贡献声明

张帅：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，软件，方法论，研究。穆斯塔法·古达：撰写 – 审稿与编辑。雷嘉月：数据管理。董玉伦：正式分析。张海亮：资源准备。詹白韶：资源准备。何勇：监督，资源准备。李晓丽：资源准备，资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（32171889, 62265007）和江西省自然科学基金（2023C02009）对当前研究的资助。