《Algal Research》：Hyperproduction of lutein and protein in a novel yellow mutant of
Chlorella sorokiniana via modulation of carbon?nitrogen metabolism under high-cell-density heterotrophic cultivation
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碳氮比调控促进异养条件下黄曲克雷伯氏菌MT03的高产叶黄素与蛋白质合成，通过两阶段培养策略实现184.46g/L生物量、481.63mg/L叶黄素及76.31g/L蛋白质产量。生理与转录组分析揭示碳限制协同氮补充调控核心代谢通路，抑制竞争途径。
陈玉成|邱泽豪|张文|黄欣欣|马瑞娟|王宝贝|何世新|陈建峰|谢友平
中国福州大学福州海洋研究所海洋生物制造中心，福州，350108
摘要
Chlorella sorokiniana 具备高细胞密度的异养培养能力，这使其在大规模、高效生产叶黄素方面具有巨大潜力。然而，其工业应用受到叶黄素含量低以及无法精确控制类胡萝卜素组成的限制。为了解决这些问题，研究人员使用了一种缺乏叶绿素且富含叶黄素的黄色突变体 C. sorokiniana MT03，研究碳氮（C/N）比例调节对异养条件下叶黄素和蛋白质生产的影响。系统优化表明，C/N 比值为 16 时效果最佳，叶黄素和蛋白质的积累量显著增加。综合生理学和转录组分析显示，碳耗尽与氮补充共同调控了中心碳代谢、大分子生物合成、血红素稳态以及类胡萝卜素生物合成途径。值得注意的是，参与脂肪酸生物合成、淀粉降解、氨基酸生物合成和类胡萝卜素形成的关键基因显著上调，这表明氮的可用性与碳的分配密切相关。血红素的积累增强了 CYP97 介导的叶黄素合成，进一步将氮的状态与类胡萝卜素的生成过程联系起来。在 5 升生物反应器中成功实施了两阶段培养策略：(I) 进行补料批次培养以生产高细胞密度生物量；(II) 在碳耗尽且氮充足的情况下触发叶黄素和蛋白质的合成。该方法最终获得了 184.46 克/升的生物量浓度，叶黄素的体积浓度为 481.63 毫克/升，蛋白质的体积浓度为 76.31 克/升，超过了文献中的大多数报道值。这些结果表明，合理的 C/N 代谢调节可以有效将碳流重新导向目标代谢物，为微藻中叶黄素和蛋白质的协同生产提供了一个可扩展且具有工业可行性的平台。
引言
叶黄素是人类视网膜黄斑色素的主要成分，具有强大的抗氧化、抗炎和天然着色作用，因此在动物饲料、食品配方和药品产品中得到广泛应用 [1]、[2]、[3]。目前，商业叶黄素主要从万寿菊中提取；然而，这种方法受到高运营成本和季节性及气候波动的影响，限制了其可持续发展和更广泛的应用 [1]。尽管微生物平台用于发酵生产叶黄素具有潜力，但漫长的生物合成途径（特别是不对称环化和羟基化步骤）带来了显著挑战，包括产量低、副产物积累和复杂的代谢调节 [4]、[5]。相比之下，微藻天然具备完整的叶黄素生物合成途径，并结合了快速生长和高叶黄素含量，使其成为最具有可持续性的天然叶黄素生产平台 [6]、[7]。
Chlorella 是一种具有商业前景的菌株，在全球范围内得到了广泛研究 [8]、[9]。传统的商业 Chlorella 培养主要依赖于光自养模式，但这受到光穿透限制和细胞遮蔽效应的影响，从而阻碍了高细胞密度的培养，进而限制了叶黄素的产量。相比之下，异养培养是一种更具工业可行性的策略，因为它可以利用有机碳源快速促进藻类增殖，在短时间内实现高生物量积累，并为高价值代谢物的生产提供可扩展的途径。最近的研究表明，Chlorella sorokiniana 可以实现超高密度的异养培养（干细胞重量 > 200 克/升），显示出其在工业规模生物生产方面的巨大潜力 [10]、[11]。然而，一个关键瓶颈仍然存在：在异养条件下，C. sorokiniana 的叶黄素含量（1.73–3.75 毫克/克干细胞重量）远低于光自养或混合营养条件下的含量（6.16–17.4 毫克/克干细胞重量）[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。尽管已经探索了结合异养生长后进行光自养或混合营养诱导的两阶段策略来提高叶黄素积累 [15]、[20]，但这些方法需要系统切换、细胞稀释和光照暴露，从而增加了工艺复杂性、能耗和运营成本，同时影响了生产的连续性和经济可行性。此外，在异养条件下，藻类细胞仍会继续合成叶绿素和其他类胡萝卜素，如紫黄质、新黄质和 β-胡萝卜素 [12]。叶绿素和类胡萝卜素都来源于共同的前体 geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) [21]。同时，其他类胡萝卜素（如紫黄质、新黄质和 β-胡萝卜素）的生物合成途径与叶黄素不同，番茄红素是它们的共同前体 [22]。因此，叶绿素和其他类胡萝卜素会与叶黄素竞争共同的代谢前体。这些共生产的色素在下游提取和纯化过程中还会引入杂质，进一步复杂化了分离过程并提高了处理成本 [23]。
通过 EMS (ethyl methanesulfonate) 诱变的黄色突变体 C. sorokiniana MT03 在异养条件下表现出叶绿素缺乏的表型，并且叶黄素积累增强，使叶黄素成为细胞内的主要色素 [24]。然而，该菌株在异养条件下的叶黄素含量仍然不够理想，目前仍缺乏有效的策略来实现高水平的叶黄素积累。调节碳氮（C/N）比例提供了一种简单而高效的策略，可以增强微藻系统中的代谢物积累并提高产量和生产力。例如，在 Chlorella sp. MBFJNU-17 的异养培养中，将生长阶段的 C/N 比率从 40（40 克/升葡萄糖，1 克/升尿素）调整到生产阶段的 1.7（5 克/升葡萄糖，3 克/升尿素），成功地将细胞内淀粉重新导向蛋白质合成，使蛋白质含量达到 59.75% [25]。同样，在 C. sorokiniana CMBB276 中，通过将 C/N 比率从 18 降低到 6 的两阶段氮喂养方法同时提高了蛋白质含量和体积浓度，使蛋白质含量达到 58.6%（w/w），最终浓度为 87.0 克/升 [26]。由于微藻细胞中的叶黄素主要与光捕获复合蛋白结合，其生物合成通常与蛋白质生产同步进行 [27]。这种共调节表明，战略性调节碳氮代谢可能同时提高异养生长微藻中的叶黄素和蛋白质积累。
在本研究中，使用黄色突变体 C. sorokiniana MT03 作为模型系统，评估不同 C/N 比率对细胞生长、营养利用和细胞组成的影响。通过综合转录组分析揭示了 C/N 调节叶黄素和蛋白质生物合成的分子机制。在 5 升生物反应器中进行的控制补料批次培养条件下进一步验证了所开发的基于 C/N 比率的代谢策略的有效性。这些结果为解决当前阻碍微藻叶黄素和蛋白质工业规模生产的关键技术瓶颈提供了合理且可扩展的框架。
微藻菌株和种子培养
黄色突变体 C. sorokiniana MT03 是通过 EMS 诱变技术获得的 [24]，储存在 -80°C 下的 15% （v/v）甘油中。解冻后，将 50 微升的藻液分配到固化的改良 Mann 和 Myer's (MM) 培养基 [12] 上，并在黑暗中于 30°C 下培养。7 天后，将藻类菌落接种到 250 毫升 Erlenmeyer 烧瓶中的 100 毫升液体 MM 培养基中，然后在 30°C 和 150 转/分钟的条件下培养 3 天以生成种子培养物。
不同碳氮比率下 MT03 的培养
250 毫升培养基中的 100 毫升新鲜培养基
不同碳氮比率对藻类生长和营养利用的影响
如图 1(a) 所示，当碳氮（C/N）比率设定为 57:1 时，硝酸钠在第 2 天被完全消耗，而葡萄糖在第 9 天被耗尽。在此期间，MT03 表现出稳定的生长，在葡萄糖耗尽后达到最大生物量浓度 5.61 克/升，之后生物量略有下降并趋于稳定。值得注意的是，在硝酸钠耗尽后，葡萄糖的消耗速率显著降低，生长阶段明显
结论
通过调节 C/N 比率来战略性调控碳氮代谢，可以有效增强异养培养的 C. sorokiniana MT03 中叶黄素和蛋白质的生物合成。综合生理学和转录组分析表明，碳耗尽与氮补充共同调控了代谢流向叶黄素和蛋白质的合成，同时抑制了其他竞争途径。使用两阶段策略（即第一阶段用于高密度生物量
CRediT 作者贡献声明
陈玉成：撰写——原始草稿，验证，概念构思。邱泽豪：方法学，研究，数据管理。张文：方法学，研究，数据管理。黄欣欣：方法学，研究，数据管理。马瑞娟：撰写——审阅与编辑，可视化，验证，概念构思。王宝贝：方法学，概念构思。何世新：撰写——审阅与编辑，概念构思。陈建峰：资源提供。谢友平：撰写——审阅与编辑，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
本研究得到了中国福建省自然科学基金（编号：2024J09039）、国家自然科学基金（编号：32202960）、福州大学仪器分析中心精密仪器测试基金（编号：2026T044）以及福州大学研究启动基金（编号：XRC-25153）的财政支持。
