使用BODIPY C12追踪Phaeodactylum tricornutum中的脂滴动态

《Algal Research》：Tracking lipid droplet dynamics using BODIPY C12 in Phaeodactylum tricornutum

荧光染料BODIPY C12用于研究浮游硅藻Phaeodactylum tricornutum在氮饥饿及恢复期脂滴动态形成与分解机制，证实其可有效标记脂滴并揭示脂代谢途径差异。

　　

作者：Ayushi Dalmia | Inna Khozin-Goldberg

实验室：微藻生物技术实验室，法国干旱地区农业与生物技术研究所，Jacob Blaustein沙漠研究所，本-古里安大学内盖夫分校，Midreshet Ben-Gurion，8499000，以色列

摘要

含油微藻是单细胞油脂生产相关基础研究和生物技术的核心。尽管已经开发出许多用于操控微藻生理和分子机制的工具，但目前仍缺乏能够实时观察体内脂滴（LD）动态的细胞生物学工具。在本研究中，我们利用荧光脂肪酸衍生物BODIPY C12（BP C12）来观察模式硅藻Phaeodactylum tricornutum的两种生态型Pt1和Pt4中的脂滴动态，以及脂肪酸在细胞内的运输过程。通过共聚焦显微镜和流式细胞术（FACS）实时观察脂滴的形成和分解过程。在营养充足条件下，被BP C12标记的细胞显示该荧光物质被包裹在微小的囊泡中；而在氮饥饿状态下，BP C12信号主要集中于已形成的脂滴中。在恢复氮供应的过程中，我们观察到含有BP C12信号的脂滴逐渐分解。薄层色谱分析表明大部分BP C12未发生酯化，但其信号同时存在于极性脂质和中性脂质中，这表明其适用于Phaeodactylum tricornutum的脂质代谢研究。这些发现为BP C12在Phaeodactylum tricornutum相关实验中的应用奠定了基础。

引言

硅藻属于链格孢门（Stramenopiles），是海洋和淡水生态系统中的重要组成部分。它们拥有由红藻与异养鞭毛虫之间二次内共生演化而来的次生质体，是碳固定的主要贡献者[1][2]。硅藻贡献了全球初级生产总量的五分之一，体现了其在维持生态系统中的关键作用[2]。 Phaeodactylum tricornutum是一种含油的单细胞硅藻，因其易于培养、基因组较小、为单倍体且具有简单的遗传转化方法而成为理想的模式生物[2]。该物种具有广盐性，栖息于海洋和半咸水环境[1]。目前已鉴定出10个Phaeodactylum tricornutum株系，编号为Pt1–Pt10[3]，最近又收集了7个新株系，编号为Pt11–Pt17[4]。其中Pt1和Pt4两种 fusiform 形态的生态型被研究得最为深入[5][6][7]。Pt1是首个完成基因组测序的株系，大部分遗传工程技术都是基于它开发的[8]，因此将其与其他生态型进行比较成为该领域的研究热点[8]。Phaeodactylum tricornutum可通过光合作用积累生物量，在氮饥饿条件下可将其生物量的30%或更多转化为中性脂质，其中20–30%为三酰甘油[9][10]。对比分析Pt1（海洋株）和Pt4（半咸水株）的基因组发现两者存在差异和多态性[11]。由于Pt4属于半咸水环境，其在系统发育上距离较远[11]。近期有多个研究团队比较了这两种株系在氮饥饿及氮供应恢复后的脂滴形成和降解模式[6]。生化检测和基因表达分析揭示了两者之间的差异[6]。 由于硅藻的含油特性，其脂质代谢成为研究重点。其复杂的细胞内结构影响了其脂质代谢途径。已有研究使用荧光染料和显微技术探讨了Phaeodactylum tricornutum及其他含油硅藻的脂质代谢和脂滴形成与降解过程[5][6][12]。我们使用BP C12作为荧光标记物，旨在观察脂滴的形成和分解过程，并评估其作为研究Phaeodactylum tricornutum脂质代谢工具的适用性。

目前有多种BODIPY衍生物可供选择。Rambold等人[13]使用红色荧光染料BODIPY 558/568 C12研究饥饿细胞中的脂肪酸运输情况。荧光染料BODIPY 581/591 C11对氧化敏感，其荧光会从绿色变为红色，可用于检测氧化反应[14][15][16]。在哺乳动物细胞中，BP C12可标记过氧化物酶体[17]。还有其他具有不同链长的脂肪酸衍生物（如BODIPY C5和BODIPY C16[16]），根据具体需求选择使用。BP C12是一种含有12个碳原子的脂肪酸类似物，其荧光基团与BODIPY荧光团共价结合。其链长与18碳脂肪酸相近，常用于非光合模型中模拟18碳脂肪酸[18]。荧光脂肪酸类似物和共聚焦显微镜等技术的出现使得脂肪酸的实时追踪成为可能。BP C12适用于活细胞染色和脂肪酸运输机制的研究，其运输和代谢过程与天然脂肪酸相似[19][20][21]，是研究脂质运输和代谢的理想工具。此前已有研究将其应用于人类胎盘和哺乳动物细胞[18][22]，但在微藻中的应用较少，仅有少数报道显示BP C12能够进入Phaeodactylum tricornutum细胞[18][23]，以及一项使用BODIPY BD C12标记Nannochloropsis中脂滴的研究[24]。因此，本研究重点探讨BP C12作为探针研究Phaeodactylum tricornutum脂滴代谢的可行性和适用性。

菌株与培养

Phaeodactylum tricornutum CCAP1055/1（Pt1）和Phaeodactylum tricornutum UTEX #646（Pt4）在半盐RSE培养基中培养，培养条件为22°C、150 rpm旋转速率、富二氧化碳环境（50 μmol photons/m2·s的光照强度）。进行氮饥饿实验时，将对数生长期的培养物离心（4500 rpm，10分钟），然后用不含氮的RSE培养基洗涤，再以10^6细胞/ml的密度接种回新的培养基中。

营养充足条件下Phaeodactylum tricornutum细胞对BP C12的摄取

首先在营养充足条件下研究了Phaeodactylum tricornutum细胞对BP C12的摄取和整合情况。培养1小时后，观察到BP C12信号被细胞内化（Pt1和Pt4均可见）。6小时时膜上信号逐渐增强，9小时时信号变得非常明显。

讨论

目前关于BP C12作为研究微藻脂肪酸运输和脂滴代谢工具的适用性的研究较少，我们选择在Phaeodactylum tricornutum中进行探索。BP C12是一种荧光标记的长链脂肪酸类似物，常用于脂肪酸运输研究[13][18]。随着共聚焦显微镜技术的进步，荧光探针的实用性得到了提升。BP C12可用于追踪细胞内脂肪酸的移动

结论

Phaeodactylum tricornutum在营养充足条件下会摄取BP C12；在氮饥饿状态下，BP C12会沉积在脂滴中，并在营养恢复过程中重新分布。BP C12的运输模式与外部供应的脂肪酸相似。实验表明，BP C12在体内会被转化为中性脂质和极性脂质，说明其被Phaeodactylum tricornutum中的脂质代谢酶所利用。因此，BP C12是一种有前景的荧光探针，适用于体内脂质代谢的可视化研究。

作者贡献声明

Ayushi Dalmia：撰写 – 审稿与编辑、原始稿撰写、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构思。 Inna Khozin-Goldberg：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资源协调、资金申请、数据分析、概念构思。

资助

本研究得到了以色列科学基金会（grant 1992/21）的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Noga Sirkon博士、Uzi Hadad博士和Carmen Segal博士在共聚焦显微镜和流式细胞仪使用方面提供的专业帮助。