《Analytica Chimica Acta》：Quantitative Assessment of Neutrophil Chemotactic Migration under Coexisting Intermediate and Terminal Chemokine Gradients in a Microfluidic Environment: Applications for Immune Dysfunction and Prognostic Evaluation in Sepsis
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本研究开发六通道双梯度中性粒细胞趋化芯片（DNC-chip），同步生成LTB4+fMLP或C5a梯度，实现高通量中性粒细胞迁移动力学分析。通过计算Euclidean距离、趋化指数等参数构建NMKC指数，发现该指数对脓毒症患者死亡率预测AUC达0.786-0.813，为临床免疫监测提供新工具。
朱跃毅|杨晓|姚宇航|方明|邵敏|查玉涛|赵军|崔俊生|任晓鸥|朱玲|蒲学学|李秋玲|杨柯
安徽大学生命科学与医学工程学院，合肥230601，中国
摘要
背景
败血症仍然是一种危及生命的疾病，主要是由于免疫失调以及难以准确评估患者预后。中性粒细胞作为先天免疫的主要效应细胞，在体内通过复杂的趋化因子环境迁移，对中间趋化因子（如IL-8、LTB4）和末端趋化因子（如fMLP、C5a）作出反应，以协调有效的抗菌和炎症反应。然而，现有的体外检测方法在模拟生理相关双梯度环境方面存在局限性，无法提供中性粒细胞迁移动态的定量、高通量分析。这一限制阻碍了对败血症中性粒细胞功能障碍机制的理解，并限制了预测性免疫监测策略的发展。
结果
我们开发了一种六通道双梯度中性粒细胞趋化芯片（DNC-chip），能够在每个检测单元内同时生成配对的趋化因子梯度（单元1-3：100 nM LTB4 + 100 nM fMLP；单元4-6：100 nM LTB4 + 100 nM C5a）。该平台实现了中性粒细胞迁移的高通量、定量评估。利用健康对照组（N_H = 20）和败血症患者（N_S = 20）的样本，我们提取了多维迁移参数，包括欧几里得距离、趋化指数、停止比率和峰值速度，构建了中性粒细胞迁移动力学综合（NMKC）指数。NMKC指数在预测死亡率方面也表现出良好的性能，LTB4 + fMLP梯度的AUC值为0.786，LTB4 + C5a梯度的AUC值为0.813。
意义
DNC-chip为在复杂双趋化因子环境下进行功能性免疫表型分析提供了一个可靠的平台。结合NMKC指数，它为败血症的客观免疫监测和死亡风险分层提供了定量框架，凸显了其在临床应用中的潜力，需要在更大规模的患者群体中进行验证。
引言
败血症是一种由宿主免疫反应失调引起的器官功能障碍的危及生命的综合征，这种失调是由炎症信号网络的严重紊乱驱动的[1]、[2]。早期识别和及时干预对于改善患者预后至关重要[3]、[4]。作为先天免疫的主要效应细胞，中性粒细胞是抵御入侵病原体（尤其是细菌）的第一道防线。它们的迁移能力对于有效的抗菌活性和炎症反应的协调至关重要[5]、[6]、[7]。
中性粒细胞的方向性迁移受到协调的趋化因子网络的严格调控[8]、[9]、[10]、[11]。在炎症早期阶段，中间趋化因子（如组织来源的白细胞介素-8（IL-8）和白细胞自分泌脂质介质白三烯B4（LTB4））会吸引中性粒细胞向炎症组织迁移[12]、[13]、[14]。而在炎症后期阶段，末端趋化因子（包括细菌肽N-甲酰甲硫基-亮氨酸-苯丙氨酸（fMLP）和补体成分5a（C5a，补体激活后产生的蛋白水解产物）会引导中性粒细胞穿过组织屏障并精确地指向感染灶[15]、[16]、[17]。在生理条件下，这两类趋化因子通过特定的受体-配体相互作用形成协同的级联信号轴，确保中性粒细胞的有效和准确导航[18]、[19]、[20]。然而，在败血症中，细胞因子风暴、微循环功能障碍和代谢紊乱等病理因素会破坏这种信号级联，导致趋化因子释放失调和下游信号传导受损[21]、[22]、[23]。这些紊乱最终导致中性粒细胞迁移缺陷，从而加剧炎症损伤和疾病进展[24]、[25]、[26]。因此，建立一种能够模拟复杂多趋化因子环境并系统评估败血症中性粒细胞趋化性的体外模型对于阐明免疫失调机制和制定针对性治疗策略至关重要。
Yan Qi等人[27]开发了一种微流控装置，该装置可以模拟生物屏障，并使中性粒细胞在fMLP刺激下迁移，展示了微流控平台在揭示病理条件下迁移缺陷方面的价值。Xiao Wang等人[28]设计了一种微流控系统，研究渐进式机械约束如何影响中性粒细胞向趋化因子的迁移行为，并报告了患者细胞与健康个体细胞之间的显著差异。Xiao Yang等人[29]将细胞分选模块与变形和趋化性评估芯片集成在一起，实现了从小体积全血中分离白细胞并自动测量中性粒细胞的变形和迁移时间。然而，大多数现有研究依赖于单一趋化因子刺激，忽略了体内中间趋化因子和末端趋化因子之间的协同作用。这一限制使得当前系统无法捕捉败血症中存在的复杂趋化因子环境，导致体外评估与实际生理或病理过程之间存在差异。
在这项研究中，我们设计并制造了一种双梯度中性粒细胞趋化芯片（DNC-chip），由六个独立且相同的检测单元组成。每个单元生成一个独立且可重复的趋化梯度，从而能够独立且并行地评估中性粒细胞的迁移。单元1-3配置了100 nM LTB4和100 nM fMLP的组合梯度，而单元4-6生成了100 nM LTB4和100 nM C5a的组合梯度。该平台实现了双趋化因子刺激下中性粒细胞趋化反应的实时和动态监测，并提供了多通道并行化、高通量能力和定量分析精度。利用该芯片，我们系统地比较了健康对照组（N_H = 20）和败血症患者（N_S = 20）的中性粒细胞迁移动态。通过量化多维迁移参数（包括欧几里得距离（ED）、趋化指数（CI）、停止比率（SR）和峰值速度（V_max）），构建了中性粒细胞迁移动力学综合（NMKC）指数。在生理相关的双趋化因子梯度下的高维实时分析显示，败血症患者的中性粒细胞功能存在明显受损。DNC-chip与NMKC分析框架的结合为表征中性粒细胞功能障碍提供了一种定量方法，并为败血症的分层免疫表型和个性化监测提供了有前景的工具。
试剂和仪器
有关试剂和仪器的详细信息请参见支持信息1。
DNC-chip设计
为了能够在同时存在中间趋化因子和末端趋化因子的情况下对中性粒细胞趋化迁移进行定量分析，我们使用SolidWorks设计了双梯度中性粒细胞趋化芯片（DNC-chip）。该芯片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）层与玻璃基底粘合而成（图1A），并集成了六个独立且相同的检测单元，以实现高通量并行分析。
DNC-chip的双梯度形成和性能验证
为了验证DNC-chip生成同时存在的中间趋化因子和末端趋化因子梯度的可靠性，我们将流体动力学模拟与荧光追踪实验相结合，系统地评估了双梯度形成的效率、稳定性和通道间一致性。模拟结果显示，芯片的圣诞树型流体网络有效地分布了试剂，在细胞迁移区域内建立了稳定且空间均匀的浓度梯度。
结论
本研究开发了一种DNC-chip，能够在同时存在中间趋化因子和末端趋化因子的情况下对中性粒细胞迁移进行高通量、定量评估。该芯片包含六个独立的检测单元，能够生成稳定的双梯度，能够在体外模拟复杂的多信号趋化环境，并表现出高可靠性、通用性和重复性。使用该平台，发现败血症患者的中性粒细胞趋化功能受损。
CRediT作者贡献声明
杨柯：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金获取、概念构思。
杨晓：撰写——初稿撰写、项目管理、方法学设计、实验实施、数据分析。
姚宇航：资源协调、概念构思。
方明：概念构思。
邵敏：概念构思。
任晓鸥：资源协调。
朱玲：资源协调、项目管理、资金获取。
蒲学学：资源协调。
李秋玲：撰写——审稿与编辑。
未引用参考文献
[47]。
伦理批准
本研究遵循HXLL-2025-62伦理协议进行，并获得了中国科学院合肥物理科学研究所的机构审查委员会批准，具体用于外周血样本的收集与分析。所有志愿者、患者或其法定代理人均签署了书面知情同意书。所有程序均遵守赫尔辛基宣言和相关国家法规。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了中国科学院青年创新促进协会（编号2021442和Y2022111）、安徽省自然科学基金（编号2308085MC75）以及合肥综合性国家科学中心工程医学与医疗设备创新研究院的重大项目（编号HFGJKXZX-YGRH-1-005）的支持。
