富含缺陷的Ce-Zr-O固溶体纳米酶具有磷酸酶活性，可用于选择性磷酸盐检测

《Analytica Chimica Acta》：Defect-Rich Ce-Zr-O Solid-Solution Nanozymes with Phosphatase Activity for Selective Phosphate Sensing

检测磷酸离子（PO?3?）的新方法：通过固体溶液策略合成具有氧空位和结构异质性的Ce-Zr-O纳米酶，显著提升灵敏度和选择性，检测限达0.061 nM，适用于尿液检测。

　　

朱莉安娜·盖桑·卡乌诺（Juliana Gaithan Kauno）|魏海莉（Haili Wei）|夏世宇（Shiyu Xia）|高文平（Wenping Gao）|佐海布·萨迪克（Zohaib Saddique）|李凤华（Fenghua Li）|吴凤霞（Fengxia Wu）|徐国宝（Guobao Xu）|徐贤宜（Hsien-Yi Hsu）|齐奥尔·雷曼（Ziaur Rehman）|田宇（Yu Tian）|牛文鑫（Wenxin Niu）

中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室，中国长春 130022

摘要

磷酸根离子（PO₄^3-）对生物体的生长至关重要，尤其是骨骼发育。然而，高水平的 PO₄^3- 可能预示着健康问题，例如高磷酸血症，这表明由于肾脏过滤功能下降导致血清中磷酸盐积累，从而引发慢性肾病。因此，迫切需要一种准确且便捷的 PO₄^3- 分析方法。鉴于其检测的重要性，已经采用了几种基于纳米酶的技术，其中荧光法是最稳健和高效的技术之一。在纳米酶方面，当前的发展存在催化活性低和非特异性抑制的问题。为了解决这些问题，我们提出了一种固态溶液策略，用于合成具有富缺陷多晶结构的 Ce-Zr-O 纳米酶，提供了一个高度特异性和高效的传感平台。该方法简单且成本低廉，能够制备出均匀性高、尺寸可控且形态良好的 Ce-Zr-O 纳米酶。将 Zr⁴⁺ 插入 CeO₂ 晶格中会诱导大量氧空位和结构异质性，从而通过增强路易斯酸催化作用和促进 4-甲基伞形花烃基磷酸酯（4-MUP）的亲核水解来协同提高磷酸酶样活性。值得注意的是，磷酸根（PO₄^3-）离子会特异性地结合到 Zr 位点，改变其电子环境并降低催化性能。利用这种选择性抑制作用，我们开发了一种具有高选择性和灵敏度的荧光法磷酸盐检测方法。Ce-Zr-O 纳米酶的检测限（LOD）为 0.061 nM，可以精确测量尿液中的磷酸盐含量。本研究提出了一种通用的 Ce-Zr-O 纳米酶缺陷工程方法，为生物流体中的抗干扰生物传感提供了一个可靠的平台。

引言

磷酸根离子（PO₄^3-）是生物体生长的基本营养素，尤其是对骨骼发育有重要影响[1]，但人体内过高的 PO₄^3- 水平可能表明存在潜在的健康问题。例如，高水平的 PO₄^3-（高磷酸血症）可能暗示慢性肾病，此时肾脏难以过滤掉 PO₄^3-，导致其在血清中积累[2]，[3]。迄今为止，已经采用了多种方法来检测 PO₄^3- 离子，包括高效液相色谱[4]、荧光[5]、[6]、比色法[7] 和电化学方法[9]，[10]。然而，其中一些技术成本高昂、耗时较长、会产生有毒废物，并且需要专门的培训[11]。因此，迫切需要一种准确且便捷的 PO₄^3- 分析方法。

纳米酶是一种先进的纳米材料，能够模拟天然酶，由于其稳定性更强且生产成本更低，因此具有很好的应用前景。基于这些优势，纳米酶已成功应用于生物传感[12]、[13]、癌症治疗[14]、化学传感[15]、[16]以及作为抗菌剂[17]。目前已鉴定出多种纳米酶，包括金属有机框架[18]、碳点[19]、金属氧化物[20]、[21]和金属纳米酶[22]、[23]、[24]。金属氧化物纳米酶具有很大的潜力，因为它们易于合成、成本低廉、毒性低、具有荧光猝灭效应、磁性质，并且具有有利的介电特性[25]。在金属氧化物纳米酶中，CeO₂ 被报道具有多酶样活性[26]，选择性掺杂已成为调节这些纳米酶催化性能的关键策略[27]，[28]。因此，我们选择了锆（Zr）作为掺杂剂，合成了具有均匀粒径分布的 Ce-Zr-O 纳米酶。Zr⁴⁺ 是一种非常有效的掺杂剂，因为它能够增强这些材料的结构和催化性能[29]。Zr⁴⁺ 的小半径（0.84 ?）降低了 CeO₂ 的配位数，导致晶格结构发生显著无序，从而改变了局部配位并形成了更长的 Zr-O 键，正如 Nelson 等人所报道的[30]。这些扩展键中的氧原子变得更加活跃，更容易释放。通常，Zr 的替代会通过在晶格中生成氧空位来扭曲 CeO₂ 的结构。值得注意的是，有报道称磷酸根是铈基纳米酶活性的强抑制剂[31]，[32]。磷酸根优先结合到 Ce³⁺ 位点，导致在纳米酶表面形成铈磷酸盐（Ce-Pi）。特别是，赵等人报道的 MIL-88A_Ce/Fe 纳米酶对 PO₄^3- 的检测限（LOD）为 940 nM[33]。袁等人使用 Eu@Ce-MOF 纳米酶实现了 64 nM 的 LOD[31]，秦等人开发的 Ce-UiO-66-NO₂ 的检测限分别为 1210 nM（荧光法）和 7600 nM（比色法）[32]。这些研究利用 Ce-Pi 相互作用形成了 Ce-O-P 键，从而调节了纳米酶的活性。然而，对 PO₄^3- 的灵敏度和选择性仍有进一步提高的空间。

固态溶液策略使用纳米级固体，在单一晶体相中两个或多个元素占据晶格位点，实现原子级别的混合并允许连续调节成分[34]。这种调节可以显著改变材料的电子、磁性和化学性质[34]，[35]。此外，通过混合元素 A 和 B，所得到的产物 AB 可以表现出 A 或 B 单独不具备的性质，或者由于 A 和 B 之间的协同作用而表现出增强的性质[36]。例如，最近在金属氧化物（M_xCe_1-x-O_2-y）的合成中也展示了固态溶液策略，这在催化应用方面取得了进展[37]，[38]，[39]。尽管在使用固态溶液策略开发铈基纳米酶方面取得了显著进展，但要精确控制活性位点的分布以及增加氧空位的浓度和流动性以增强铈基纳米酶的催化活性仍然是一个重大挑战。

在这里，我们报道了通过固态溶液策略制备的空心 Ce-Zr-O 纳米酶（图 1）。这种方法简单且成本低廉，制备出的多晶 Ce-Zr-O 具有优异的均匀性、可控的尺寸和形态。我们的研究发现，将 Zr⁴⁺ 插入 CeO₂ 晶格中会诱导大量氧空位，促进电子转移，提高效率和灵敏度，并增强结构异质性。这些氧空位提供了大量的未饱和催化位点，改善了底物吸附并加速了表面反应。此外，Zr 的引入通过促进路易斯酸催化作用和促进 4-甲基伞形花烃基磷酸酯（4-MUP）的亲核水解来增强磷酸酶样活性，从而形成了识别 PO₄^3- 的特异性位点。当 PO₄^3- 被引入时，它会结合到锆位点并破坏磷酸酶样的催化活性，从而抑制酶的活性。该检测方法表现出出色的选择性和灵敏度，证实了其在尿液中检测 PO₄^3- 的潜力。本研究为开发高性能生物医学诊断工具提供了强大且可扩展的途径。

材料与试剂

硝酸铈六水合物（Ce(NO₃)₃·6H₂O）、氧化锆（ZrOCl₂·8H₂O）、4-甲基伞形花烃基磷酸酯（4-MUP）、对硝基磷酸盐（p-NPP）和次磷酸氢钠一水合物（H₂NaO₃P）均从 Aladdin 购买。ZrO₂ 从南京 XFNano Materials Tech Co., Ltd 购买。HEPES 从 Innochem 购买。乙二醇（EG）来自中国医药化学试剂有限公司。碘化钠（NaI）、溴化钠（NaBr）和醋酸钠（CH₃COONa）来自其他供应商。

表征

为了设计高性能的固态溶液纳米酶，通过 Kirkendall 效应合成了 Ce-Zr-O 纳米酶，该效应依赖于系统中各物种的不同扩散速率[43]。采用了两步合成方法[40]。首先使用硝酸铈（III）作为前体，在 180 °C 下通过溶剂热法制备 CeO₂ 纳米颗粒，持续 16 小时。随后，在获得 CeO₂ 纳米颗粒后，向其中加入氧化锆（ZrOCl₂·8H₂O）。

结论

总之，本研究建立了一种基于固态溶液的合成策略，用于构建具有富缺陷多晶结构的 Ce-Zr-O 纳米酶，通过水热过程利用 Kirkendall 效应实现。合成的 Ce-Zr-O 纳米酶在水介质中对 PO₄^3- 离子表现出高灵敏度和选择性。重要的是，磷酸酶样的催化活性使 Ce-Zr-O 纳米酶能够准确量化磷酸盐水平。

CRediT 作者贡献声明

吴凤霞（Fengxia Wu）：写作——审稿与编辑、可视化。李凤华（Fenghua Li）：方法学、监督、验证。徐国宝（Guobao Xu）：资源提供。朱莉安娜·盖桑·卡乌诺（Juliana Gaithan Kauno）：数据管理、正式分析、研究、方法学、验证、初稿写作、审稿与编辑。田宇（Yu Tian）：写作——审稿与编辑。牛文鑫（Wenxin Niu）：概念构思、写作——审稿与编辑、监督、资金获取。齐奥尔·雷曼（Ziaur Rehman）：写作——审稿与编辑。徐贤宜（Hsien-Yi Hsu）：写作——审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究工作。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2024YFE0211700）、国家自然科学基金（编号 22374144、22204160）和吉林省科技厅（编号 20230505016ZP）的支持。