《Analytica Chimica Acta》：A CRISPR/dCas9 mediated electrochemical impedimetric biosensor for sensitive mtDNA detection
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线粒体DNA突变检测中，开发无需预扩增的高灵敏电化学传感器至关重要。本研究构建CRISPR/dCas9介导的电化学阻抗生物传感器，通过dCas9特异性解旋DNA双链释放单链触发HCR信号放大，利用PEI-Ag NPs电沉积实现阻抗信号转换，检测限达67 fM。该方法在10%人血浆干扰下仍保持90.0%-108.0%回收率，成功应用于细胞裂解液mtDNA突变检测，为早期癌症诊断提供新工具。
陈飞|黄梦琴|曾书|万毅|秦安军|杨新哲|傅丹峰|马苏德·内加达里|张成辉
中国海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室海洋科学学院，人民路56号，海口570228
摘要
背景
细胞中线粒体DNA（mtDNA）突变的积累与多种人类疾病密切相关。检测mtDNA中的单核苷酸变异（SNV）对于理解含有致病性变化的mtDNA的异质性至关重要。虽然基于传统核酸测序的方法非常有用，但它们复杂且难以揭示mtDNA的广泛多样性。为了实现微量DNA分析，最近开发的CRISPR/Cas检测方法虽然通过目标预扩增提高了检测效率，但也增加了非特异性扩增和交叉污染的风险。因此，迫切需要开发新的方法来实现mtDNA中SNV的灵敏和精确检测。
结果
本研究开发了一种无需目标预扩增的CRISPR/dCas9（失活Cas9）介导的电化学阻抗生物传感器，用于mtDNA中SNV的灵敏和特异性检测。dCas9/sgRNA复合物被固定在氧化铟锡（ITO）电极表面，以特异性识别目标mtDNA序列并引发杂交链反应（HCR）以实现信号放大。随后，带正电的聚乙烯亚胺涂层银纳米颗粒（PEI-Ag NPs）通过静电沉积在HCR生成的长双链DNA（dsDNA）产物上，由于纳米颗粒的高导电性，导致电化学阻抗显著降低。通过电化学阻抗谱（EIS）监测阻抗变化来定量mtDNA浓度。该方法能够在无需预扩增的情况下区分单碱基和多碱基错配，检测限低至67 fM。它在复杂基质（10%人血浆）中表现出优异的抗干扰能力和90.0%至108.0%的回收率，并能准确检测细胞裂解液中的mtDNA。
意义
这种无需预扩增的策略提供了一种高度灵敏的分析工具，能够成功检测多种细胞类型中的mtDNA突变，并在复杂的生物样本中表现出优异的抗干扰能力。这项工作为癌症相关生物标志物的电化学检测提供了一种可行且有前景的方法，显示出在早期临床诊断中的巨大潜力。
引言
线粒体DNA（mtDNA）作为细胞中唯一的细胞外遗传物质，已被证明是母系遗传的[1]，[2]。由mtDNA突变引起的异质性被认为与多种人类疾病有关，包括肾衰竭[3]、心脏病[4]、糖尿病[5]、癌症[6]、身材矮小[7]等[8]。例如，Park等人报告称，携带异质性mtDNA突变的细胞系表现出显著增强的肿瘤生长[9]。因此，快速、高选择性、高灵敏度地检测mtDNA中的基因突变，特别是单核苷酸变异（SNV），对于识别与mtDNA突变相关的疾病至关重要[10]。近年来，直接测序作为金标准在揭示mtDNA的丰富多样性方面发挥了重要作用[11]。Sanger测序[12]是最常用的mtDNA突变分析技术，但存在耗时和劳动强度大的明显缺点[13]。下一代测序（NGS）[14]具有高通量特性，可以检测未知突变[15]，但仍然成本高昂且容易出错[16]。焦磷酸测序方法显著提高了检测速度[17]，但准确性较低[18]。因此，提出了其他替代方法，如变性高效液相色谱（DHPLC）[19]、聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）[20]和TaqMan实时基因分型检测[21]。尽管DHPLC需要昂贵且复杂的仪器[22]，但其高度自动化和灵敏度使其成为分析异质性突变的首选方法。PCR-RFLP和TaqMan方法在检测多重SNV时经常出现假阳性结果[23]。因此，仍迫切需要一种可靠、灵敏、快速且低成本的方法。
最近，规律间隔短回文重复序列及相关核酸酶（CRISPR/Cas）系统作为一种强大的核酸检测工具出现[24]，[25]，[26]，因为它们具有高目标序列特异性、可编程性和等温扩增潜力[27]。然而，未经目标预扩增的CRISPR/Cas直接检测的限界在皮摩尔级别[28]，[29]，无法满足微量DNA分析的需求。因此，许多基于CRISPR/Cas的检测方法都加入了目标预扩增步骤，如环介导的等温扩增（LAMP）[30]、重组酶聚合酶扩增（RPA）[31]、基于核酸序列的扩增（NASBA）[32]等[33]。这些方法大大提高了检测灵敏度，但也增加了非特异性扩增[34]和交叉污染[35]的风险。因此，开发一种无需预扩增的CRISPR/Cas工具仍然是必要的且有价值的尝试。为了应对上述挑战，巧妙结合后扩增策略和纳米材料可能是提高CRISPR/Cas系统灵敏度的另一种途径[36]。失活的Cas9（dCas9）[37]作为CRISPR/Cas的一部分，保留了靶向和特异性双链DNA解旋的功能，可以为特定的后扩增策略提供理想的靶点[38]。值得注意的是，解旋活性容易受到邻近原间隔序列（PAM）附近碱基错配的影响，这可能为SNV检测提供足够的特异性[39]。杂交链反应（HCR）是一种高效且特异性的序列触发信号放大系统[40]。它利用特制的寡核苷酸发夹产生带有数十到数百个重复单元的切口双链，从而将输出信号放大数百倍[41]，显著提高检测灵敏度[42]。DNA对金属阳离子具有高亲和力[43]，HCR产物的DNA超结构为核酸-纳米材料的自组装提供了完美的支架[44]。此外，Ag NPs因其优异的电荷传输能力而被广泛用于基于DNA的纳米材料电化学生物传感器[45]，[46]。电化学阻抗生物传感器将电极-电解质界面处的特定生物识别事件转化为可量化的电化学阻抗谱变化[47]，[48]。其对微妙界面变化的极高灵敏度使其能够高精度检测微量生物分子目标[49]，并且其与各种纳米材料和信号放大策略的兼容性进一步扩展了其在高级生物分析中的应用[50]。因此，结合CRISPR/dCas9系统和基于DNA的纳米材料电化学阻抗生物传感器的优点可能是mtDNA SNV检测的理想选择。
在这里，我们设计了一种基于CRISPR/dCas9的电化学生物传感器，用于检测mtDNA中的基因突变。结合后，dCas9复合物局部解旋双链DNA（dsDNA），释放非目标链。这条单链作为触发剂，启动H1和H2发夹探针之间的级联杂交反应，形成双链DNA聚合物。随后，带负电的DNA聚合物与带正电的聚乙烯亚胺涂层银纳米颗粒（PEI-Ag NPs）之间的静电相互作用促进了纳米颗粒的沉积。这显著降低了电极界面处的阻抗，从而在电化学阻抗谱（EIS）信号中产生明显下降，实现了目标mtDNA的灵敏和定量检测。
材料与试剂
所有HPLC纯化的寡核苷酸均由Sangon（上海，中国）合成，详细序列信息见表S1和S2。EnGen Spy dCas9蛋白、1× NEBuffer r3.1和HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA合成试剂盒购自NEB（北京，中国）。Dyne由华南理工大学的秦安军教授提供。本研究中使用的其他所有化学试剂均为分析级，并根据实验操作制备成溶液。
CRISPR/dCas9介导的mtDNA检测生物传感器机制
mtDNA中的突变及其积累与衰老相关疾病的发展密切相关。有效和灵敏的mtDNA突变监测对于疾病的早期诊断和识别非常重要。本文提出了一种CRISPR/dCas9介导的阻抗生物传感器，用于超灵敏检测mtDNA，其详细原理如图1所示。首先，我们制备了一个活化的乙炔基功能化ITO电极表面。
结论
总之，我们开发了一种无需预扩增且高度灵敏的mtDNA检测电化学生物传感器，利用了CRISPR/dCas9的精确靶向能力和HCR的有效信号放大作用。由带负电的HCR产物驱动的PEI-Ag NPs在ITO电极上的静电沉积导致了显著的阻抗变化，从而实现了mtDNA的准确定量。所提出的生物传感器在SNV检测方面表现出优异的性能。
CRediT作者贡献声明
陈飞：撰写 – 原始草稿、方法学、研究、数据管理。张成辉：监督、资源获取、方法学、概念构思。黄梦琴：研究、数据管理。万毅：撰写 – 审稿与编辑、资金获取、概念构思。曾书：撰写 – 审稿与编辑、方法学、资金获取、概念构思。马苏德·内加达里：软件、研究。傅丹峰：软件、研究。杨新哲：方法学。秦安军：方法学
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们衷心感谢国家自然科学基金（编号：22204036、42166001）、海南省的科学技术专项资金（编号：ZDYF2025XDNY066、ZDYF2025SHFZ061）、海南大学的研究基金（编号：KYQD(ZR)-20136）以及海南大学海洋科学技术协同创新中心（编号：XTCX2022HYC13）的支持。
