苯扎氯铵通过干扰线粒体功能以及SIRT3-SOD2抗氧化轴，影响卵子的成熟过程及其发育潜能

《Animal Reproduction Science》：Benzalkonium Chlorides Compromise Oocyte Maturation and Developmental Competence by Disrupting Mitochondrial Function and the SIRT3-SOD2 Antioxidant Axis

苯扎氯铵（BACs）作为替代防腐剂，其生殖毒性机制研究不足。本研究通过体外成熟模型，发现BACs显著抑制猪卵母细胞成熟、受精及胚胎发育，并导致线粒体功能障碍、氧化应激及SIRT3-SOD2抗氧化轴抑制。机制研究表明，BACs通过线粒体途径干扰卵母细胞质量，为评估新兴消毒剂生殖风险提供新证据。

　　

作者列表：Lay Khienduc、Zhang Dandan、Wang Hui、Li Mengchan、Zhang Yongteng、Xu Qimei、Jia Bo、Nguyen ThiHien、Ren Chunhuan、Zhou Xiaoyan、Tang Heng、Ling Yinghui、Wu Mengting、Gao Yang、Zhang Mianqun、Zhang Yunhai

安徽农业大学动物科学技术学院，安徽省地方畜禽遗传资源保护与繁殖重点实验室，中国合肥，230036

摘要

苯扎氯铵（BACs）是一类季铵化合物（QACs），广泛用作消毒剂和防腐剂。在全球范围内限制使用三氯生和三氯卡班后，它们逐渐取代了这些物质在个人护理产品中的应用。然而，BACs的潜在生殖毒性仍大多未被探索。本研究调查了BACs对猪卵母细胞成熟和受精能力的影响及其背后的线粒体机制。卵母细胞在含有0.2-50.0 μg/mL BACs的体外成熟（IVM）培养条件下培养44小时。结果显示，BACs暴露显著抑制了卵丘细胞的扩张，减少了第一极体的排出，并以剂量依赖的方式影响了受精和早期胚胎发育。细胞学分析显示纺锤体组装受损，微管稳定性降低，F-肌动蛋白结构紊乱。BACs还导致皮质颗粒分布异常，Ovastacin表达减少，精子结合能力下降。机制上，BACs诱导线粒体去极化，线粒体数量减少，线粒体ROS升高，以及Ca2?稳态失衡，从而导致氧化应激、DNA损伤、细胞凋亡和自噬-溶酶体失衡。此外，BACs暴露还抑制了线粒体SIRT3-SOD2抗氧化轴；而通过UBCS039激活SIRT3或用Mito-TEMPO清除ROS可部分恢复线粒体功能障碍和卵母细胞成熟缺陷。总体而言，这些发现表明BACs通过线粒体氧化应激和SIRT3-SOD2轴抑制作用损害卵母细胞的质量和发育能力，为新兴消毒剂污染物的生殖风险提供了新的见解。

引言

自20世纪60年代以来，三氯生（TCS）和三氯卡班（TCC）等抗菌剂被广泛用于消费品和个人护理产品中（Adhikari等，2022；Wang等，2021）。然而，这些化合物具有高环境持久性，并已被证明会干扰生殖和发育过程，包括破坏性激素平衡、降低精子质量、损害胚胎发育，同时还会增加抗生素耐药性和其他健康风险（Gan等，2025）。因此，许多国家和地区逐步限制或禁止在日常产品中使用TCS和TCC（Halden等，2017）。为替代这些化合物，制造商越来越多地采用苯扎氯铵（BACs）、苯乙基氯铵（BECs）和氯oxylenol（CX）（Raps等，2024；Trasande等，2024）。其中，作为典型的季铵化合物（QACs），BACs具有广谱抗菌和抗病毒特性，广泛应用于制药、医院消毒剂和家用清洁产品（Baudouin等，2010；Hussey，1976）。值得注意的是，在COVID-19大流行期间及之后，含BACs的消毒剂使用量激增，显著增加了环境和人类接触的风险（Kim等，2022；Mahony等，2023）。这种使用量的增加进一步加剧了广泛暴露的风险。 越来越多的研究开始揭示BACs的毒理学特性。作为使用最广泛的QACs之一，BACs常见于住宅、医疗和工业环境中，尤其是C12-C16烷基链长度的同类化合物（Kong等，2024；Mohapatra等，2024）。它们的杀菌活性依赖于阳离子季铵基团与细菌膜的相互作用，随后烷基链破坏脂质双层，从而产生广谱抗菌效果。然而，这一特性也使其在环境和生物系统中具有强烈的膜破坏潜力（Larsson等，2024；Zhang等，2025）。证据表明，BACs可引起人类角膜和鼻上皮细胞的细胞毒性，并与接触性皮炎和呼吸道过敏有关（Baudouin等，2010；Kahook等，2024）。在水生生态系统中，即使在环境相关浓度下，BACs也会对藻类、甲壳类动物和鱼类产生急性和慢性毒性，导致繁殖受阻、胚胎畸形、孵化延迟和幼体死亡率增加（Melin等，2016；Mukai等，2024；Patton等，1999）。在哺乳动物模型中，长期暴露于BACs或其混合物（如ADBAC+DDAC）会显著降低生殖性能，包括受精时间延长和产仔数减少（Buttar，1985）。此外，BACs还被报道具有潜在的内分泌干扰活性，例如上调卵黄生成基因（Kim等，2020）。尽管有这些发现，但大多数关于生殖毒性的证据来自水生或低等动物模型，而关于高等哺乳动物——特别是女性生殖系统的数据仍然有限。关键的是，目前尚无研究直接评估BACs是否会影响哺乳动物卵母细胞的质量、减数分裂进程或受精能力，这是一个重要的知识空白。 近年来，全球不孕率持续上升，成为仅次于癌症和心血管疾病的第三大慢性公共卫生问题，影响约8-12%的育龄夫妇，其中女性因素在反复妊娠失败中起着重要作用（Chapron等，1994；Fauser等，2024）。尽管辅助生殖技术（如体外受精-胚胎移植IVF-ET）有所进步，但仍有一部分患者因配子质量下降或子宫内膜接受性不足而经历妊娠失败（de Ziegler和Frydman，2021；Subirá等，2025；Zhang等，2025）。环境污染物暴露被认为是导致生育能力下降的主要外源性因素，内分泌干扰化学物质（EDCs）如邻苯二甲酸酯和双酚类对卵母细胞质量和胚胎发育的有害影响已有充分记录（Machtinger和Orvieto，2014；Puche-Juarez等，2023）。相比之下，尽管QACs在环境中的使用量迅速增加，但关于其对女性生殖健康的影响的研究却很少（Zheng等，2021；Belova等，2023；Cao等，2024）。作为代表性的QACs，BACs被认为具有细胞毒性和遗传毒性；然而，它们是否会影响卵母细胞的质量和受精能力仍不清楚。 卵母细胞作为生育能力和早期胚胎发育的基本决定因素，对外源化学压力极为敏感。由于它们对线粒体破坏和氧化应激的异常敏感性，卵母细胞成为评估化学物质生殖毒性的生物学相关靶标。选择猪卵母细胞是因为其大小、减数分裂特征、线粒体生理和发育模式与人类卵母细胞高度相似，为机制评估提供了可靠的转化模型。基于这些空白，我们假设BACs暴露可能通过诱导线粒体功能障碍和氧化应激来破坏卵母细胞的成熟和受精能力。为此，我们使用与人类卵母细胞生理相似的猪卵母细胞，评估不同浓度的BACs对卵丘细胞扩张、减数分裂进程、受精、早期胚胎发育以及关键线粒体指标（包括膜电位、mtROS水平和SIRT3-SOD2通路）的影响。本研究首次直接证明了BACs在卵母细胞水平上的生殖毒性，并为新兴消毒剂相关污染物的健康风险评估提供了重要启示。

抗体和化学品

所有与动物护理和使用相关的程序均遵循《农业动物在研究和教学中的护理和使用指南》进行，屠宰按照《中国生猪屠宰规定》的标准执行。本研究中使用的猪卵巢来自当地屠宰场，未对活体动物进行实验。除非另有说明，本研究中使用的所有化学品和试剂均购买自商业渠道。

BACs抑制卵丘细胞扩张，降低卵母细胞成熟，并损害早期胚胎发育

为了研究不同浓度BACs对猪卵母细胞IVM的影响，将卵母细胞在含有0.2、2.0、10.0和50.0 μg/mL BACs的IVM培养基中培养44小时。首先评估了IVM 44小时后的第一极体排出率（MII率）。与对照组相比，BACs暴露显著降低了MII率（对照组：77.6 ± 1.2%，n = 120；0.2 μg/mL：73.9 ± 1.8%，n = 115，p < 0.05；2.0 μg/mL：65.9 ± 1.9%，n = 119，p < 0.01；10.0 μg/mL：39.0 ± 3.1%，n = 116，p < 0.05）。

讨论

本研究采用猪卵母细胞作为模型系统，因为它们与人类卵母细胞在形态和生理上高度相似，系统评估了广泛使用的季铵消毒剂BACs对卵母细胞成熟和受精能力的影响。研究发现，BACs显著损害了卵母细胞的成熟和发育潜力，伴随线粒体功能障碍和氧化应激。

作者声明

作者确认已获得所有必要的机构批准，用于实验动物的伦理使用，并在手稿中明确说明。我们还确认遵守了关于知识产权和出版政策的机构和国家规定。

同意发表

所有作者均已审阅并批准了手稿的最终版本，并同意将其提交发表。

未引用的参考文献

(Kundakovic和Champagne，2011；Lopez等，2024；Sanidad等，2018；van der Reest等，2021；Yildirim和Seli，2024a；Yildirim和Seli，2024b；Yokonishi等，2020)

资助

本工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFD13000502）、国家自然科学基金（32272881）、安徽省自然科学基金（2308085QC82）、苏州市健康与 Wellness科学研究项目（SZWJ2023a013）和安徽省大学生创新创业培训计划（S202514098085）的支持。我们感谢浙江大学的Xiong教授的支持。

CRediT作者贡献声明

Zhou Xiaoyan：撰写——初稿、项目管理和方法学。 Ren Chunhuan：撰写——初稿、项目管理和方法学。 ThiHien Nguyen：软件开发、数据分析、数据管理。 Jia Bo：撰写——初稿、资源协调、项目管理和调查。 Zhang Yunhai：撰写——审稿与编辑、监督、方法学和资金争取。 Wu Mengting：方法学、调查。 Dandan Zhang：验证、监督、资源协调、数据管理。 Ling

利益冲突

作者声明没有可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。