《Journal of Virology》：A dual role for ER-Golgi cargo receptor LMAN1 in supporting CSFV replication and restraining RLR signaling
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这篇研究揭示了一个关键宿主因子——内质网-高尔基体货物受体LMAN1（Lectine mannose-binding 1）在猪瘟病毒（CSFV）感染中的双重作用机制。它既通过与病毒RNA聚合酶NS5B结合促进病毒复制复合体（VRCs）的形成，有效增强病毒RNA合成；又作为RIG-I样受体（RLR）信号通路的负调控因子，通过其碳水化合物识别结构域（CRD）抑制下游干扰素-β（IFN-β）的产生，从而帮助病毒实现免疫逃逸。这项工作为理解病毒-宿主互作提供了新视角，并提示LMAN1是潜在的抗病毒干预靶点。
LMAN1在CSFV感染期间的表达谱
研究表明，在CSFV感染后，宿主蛋白LMAN1的表达量显著上调。动物实验和体外细胞（PK-15细胞）感染模型均证实，无论是感染猪只的多种组织（如扁桃体、脾脏、肾脏和肠道）还是感染细胞中，LMAN1在mRNA和蛋白水平均呈现上调趋势。免疫组织化学结果进一步显示，CSFV感染组织中LMAN1蛋白的信号明显增强。这些数据共同表明CSFV感染能够诱导宿主LMAN1的表达。
LMAN1促进CSFV在病毒RNA复制阶段的增殖
通过稳定敲低和过表达LMAN1的细胞模型，研究证实LMAN1是CSFV高效增殖所必需的宿主因子。敲低LMAN1导致病毒E2蛋白表达减少、子代病毒滴度（TCID50）降低；而过表达LMAN1则产生相反的效应。通过同步化感染实验分析病毒生命周期的早期阶段，发现LMAN1敲低并不影响病毒附着和内存作用，但会显著损害病毒基因组RNA（vRNA）的复制。这明确了LMAN1在支持病毒RNA复制中的具体作用。
LMAN1与CSFV RNA聚合酶NS5B相互作用并共定位
为了探究LMAN1影响病毒复制的分子机制，研究检测了LMAN1与CSFV各蛋白的相互作用。通过免疫共沉淀和共聚焦显微镜观察，发现LMAN1与CSFV的非结构蛋白NS5B（病毒的RNA依赖性RNA聚合酶）存在直接的物理相互作用，并在细胞内发生显著共定位。这表明LMAN1可能通过与复制机器核心成分的直接结合来参与病毒复制。
LMAN1通过其CRD结构域与NS5B结合
LMAN1是一个包含信号肽、碳水化合物识别结构域、螺旋/茎结构域、跨膜区等结构域的蛋白。通过构建一系列截短体和点突变体，并利用基于膜定位的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析和免疫共沉淀实验，研究证实LMAN1的碳水化合物识别结构域（CRD）是其与NS5B结合所必需的区域。缺失CRD结构域的突变体（ΔCRD）完全丧失了与NS5B相互作用的能力。
LMAN1通过其CRD结构域影响CSFV的增殖
利用CRISPR-Cas9技术构建了LMAN1基因敲除的PK-15细胞系（LMAN1-KO）。在LMAN1-KO细胞中，CSFV的增殖受到显著抑制。当在敲除细胞中回补全长LMAN1（Rescue-FL）时，病毒增殖能力得以恢复；然而，回补缺失CRD结构域的LMAN1（Rescue-ΔCRD）则无法恢复病毒增殖。这直接证明了LMAN1的CRD结构域对其支持CSFV复制的功能不可或缺。
LMAN1被募集至CSFV复制复合体并促进高效病毒RNA合成
在CSFV感染或NS5B表达的细胞中，LMAN1与双链RNA（dsRNA，病毒RNA复制的中间体标志物）以及内质网（ER）标志物CANX在胞内特定结构上发生强烈共定位，表明LMAN1被募集到了病毒复制位点。对分离的粗复制复合体（CRC）进行分析，发现随着病毒感染剂量增加，CRC组分中LMAN1的含量也相应增加。此外，LMAN1敲除显著减少了细胞内dsRNA阳性的复制工厂数量，并且病毒RNA在感染后6小时的复制水平明显降低。这些结果综合表明，LMAN1被招募到内质网来源的病毒复制膜结构上，参与病毒复制复合体的形成，从而促进高效的病毒RNA合成。
LMAN1缺陷在CSFV感染期间增强抗病毒转录反应
对野生型（WT）和LMAN1-KO细胞在CSFV感染不同时间点进行RNA测序（RNA-seq）分析。结果显示，LMAN1缺失导致差异表达基因（DEGs）数量随时间增加，特别是在感染48小时后，大量与免疫和应激反应相关的通路被激活。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析发现，RIG-I样受体（RLR）信号通路是上调最显著的途径之一。热图显示，该通路中的关键分子，如传感器蛋白RIG-I（DDX58）、MDA5（IFIH1），衔接蛋白MAVS，以及下游转录因子IRF3等的编码基因在KO细胞中均呈现协调性上调，提示先天免疫应答在LMAN1缺失时被过度激活。
LMAN1缺陷增强RLR信号传导并强化抗病毒应答
在蛋白水平上，Western blot检测证实，CSFV感染后，LMAN1-KO细胞中MDA5、DDX58、MAVS、IRF3和NF-κB p65的总蛋白水平，以及IRF3（Ser396位点）和p65（Ser468位点）的磷酸化水平均显著高于WT细胞。功能实验表明，LMAN1-KO细胞在受到CSFV或多聚肌苷酸:多聚胞苷酸（poly(I:C)）刺激后，其IFN-β启动子报告基因活性以及IFN-β的蛋白分泌量都显著增强。进一步通过小干扰RNA敲低MAVS，可以完全逆转LMAN1缺失导致的干扰素反应过度激活，证明LMAN1是通过作用于MAVS信号通路上游来调控免疫应答。回补实验表明，全长LMAN1能够抑制KO细胞中过度的抗病毒信号，而缺失CRD结构域的突变体则失去了这种抑制能力，说明CRD结构域同样是LMAN1负调控RLR信号通路所必需的。
讨论与模型
本研究揭示了ER-高尔基体货物受体LMAN1在CSFV感染中扮演的双重角色。一方面，LMAN1通过其CRD结构域直接与病毒RNA聚合酶NS5B相互作用，被募集到内质网来源的复制膜上，促进病毒复制复合体的形成和病毒RNA的高效合成，这是其支持病毒复制的“促病毒”功能。另一方面，LMAN1作为RLR-MAVS信号通路的负调控因子，抑制IRF3和NF-κB的激活以及下游IFN-β的产生，协助病毒实现免疫逃逸，这是其“免疫调节”功能。值得注意的是，这两种功能都依赖于LMAN1的CRD结构域。在LMAN1缺失的情况下，病毒复制复合体形成缺陷，导致病毒RNA更易被胞质传感器如RIG-I/MDA5识别，从而过度激活MAVS依赖的信号通路，产生更强的I型干扰素反应，这反过来又进一步抑制病毒复制。该研究拓展了LMAN1超越经典货物运输功能的新角色，为理解正链RNA病毒如何劫持宿主因子协调复制与免疫逃避提供了新机制，并提示靶向LMAN1可能成为抗病毒干预的新策略。
