《Journal of Virology》：Interaction of coronavirus E protein with BRD2 plays important regulatory roles in viral replication and induction of pro-inflammatory response
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本研究揭示了一个冠状病毒致病的关键机制：病毒E蛋白与宿主表观调控蛋白BRD2相互作用，协同激活NF-κB通路，加剧促炎因子风暴，为靶向宿主因子治疗严重冠状病毒感染提供了新视角。（推荐字数：110字）
严重冠状病毒感染通常导致促炎细胞因子和趋化因子的过度分泌，引发细胞死亡乃至免疫系统崩溃，造成致命后果。深入研究宿主-病原体相互作用，对于阐明COVID-19等冠状病毒感染的免疫致病机制至关重要。本研究发现，冠状病毒感染会上调BET家族蛋白成员BRD2的表达，并激活NF-κB信号通路。更为关键的是，研究证实了冠状病毒E蛋白与BRD2之间存在直接的物理互作，两者在感染过程中协同作用，共同促进了宿主的促炎反应。
BET家族基因在冠状病毒感染中被差异性诱导
转录组学分析初步表明，禽传染性支气管炎病毒感染可显著上调宿主染色质重塑和炎症通路。尽管冠状病毒E蛋白已知具有多种免疫调节功能，且已有蛋白质组学研究提示其可能与BET家族蛋白相互作用，但具体机制不明。研究发现，在H1299细胞中，IBV感染可差异性诱导BET家族基因的转录：BRD2和BRD4的mRNA水平分别被诱导了2.4倍和1.5倍，而BRD3的表达则有所下降。进一步的时序感染实验扩展了这一观察，在感染了γ冠状病毒IBV、α冠状病毒猪流行性腹泻病毒以及低致病性人冠状病毒HCoV-229E和HCoV-OC43的多种细胞中，BET家族基因的表达呈现出复杂而差异性的诱导模式。例如，在PEDV、HCoV-229E和HCoV-OC43感染的H1299细胞以及IBV感染的DF1细胞中，BET家族基因的表达被显著诱导超过10倍。然而，在蛋白水平上，BRD2的表达在多种冠状病毒感染的晚期却呈现下调趋势，这表明mRNA水平的诱导并不总是能转化为相应的蛋白表达变化，可能受到mRNA降解、蛋白降解、翻译后修饰等多种因素的调控。
BRD2蛋白与冠状病毒E蛋白C端区域的相互作用
此前的大规模蛋白质组学分析曾提示SARS-CoV-2的E蛋白可能与BRD2和BRD4存在互作。本研究通过共免疫沉淀实验证实，IBV、SARS-CoV和SARS-CoV-2的E蛋白均能与BRD2发生特异性结合。为了精确定位互作区域，研究人员构建了BRD2的截短体。实验结果表明，包含BDII结构域的BRD2-C1区域是介导与IBV E蛋白结合的关键部位，这一发现同样适用于SARS-CoV和SARS-CoV-2的E蛋白。另一方面，对E蛋白的结构域分析显示，其与BRD2的结合主要依赖于不包含跨膜结构域的C末端区域，而N末端的跨膜结构域并非互作所必需。这些数据共同证实，冠状病毒E蛋白通过其C端区域，与BRD2蛋白的BDII结构域发生特异性相互作用。
冠状病毒感染细胞中BRD2从细胞核到细胞质的重定位及其与病毒粒子的关联
在正常的未感染细胞中，BRD2蛋白主要定位于细胞核。然而，在IBV感染的Vero细胞中，免疫荧光和共聚焦显微镜观察发现，从感染后8小时开始，尽管大部分BRD2仍留在核内，但已有少部分但显著比例的BRD2蛋白被转位到了细胞质中。有趣的是，这部分胞质BRD2与病毒双链RNA的定位并不重叠，但在感染后12小时，观察到BRD2与IBV的N蛋白存在部分共定位，提示胞质滞留的BRD2可能通过其与E蛋白的相互作用，被招募到正在组装的病毒粒子上。细胞核与细胞质蛋白分级分离实验进一步量化了这一过程：在IBV感染期间，胞质中BRD2的相对蛋白水平从感染后8小时的8.4%逐渐上升至20小时的34.2%，而核内BRD2水平相应地从55.1%下降至21.8%，胞质/核BRD2的比例在感染晚期达到峰值。这些结果证明，冠状病毒感染会导致一部分BRD2蛋白滞留于细胞质，这很可能是通过与病毒E蛋白的互作实现的。
BRD2与部分纯化病毒粒子的松散关联及其内源性互作验证
为了探究胞质BRD2是否被整合进病毒粒子，研究团队对IBV颗粒进行了蔗糖密度梯度离心纯化。初步通过20%蔗糖垫沉淀部分纯化的病毒颗粒中，能够检测到明显的BRD2蛋白结合。然而，经过更精细的20%-60%蔗糖梯度超速离心纯化后，在含有主要病毒粒子的组分中，BRD2的富集并不显著，仅在浓缩后的部分组分中能微弱检测到。使用部分纯化的病毒颗粒进行的共免疫沉淀实验，在更接近生理的相关环境下证实，内源性的BRD2蛋白特异性地与病毒的E蛋白发生互作，而与另外三种结构蛋白S、N或M则无此相互作用。这表明，在感染细胞中转位至胞质的BRD2确实与E蛋白结合，并因此与病毒粒子产生一种松散的关联，而非作为结构蛋白被紧密包装进去。
BRD2蛋白调控冠状病毒复制与细胞凋亡
为了研究BRD2在调控冠状病毒感染中的生物学功能，研究团队利用靶向BRD2的短发夹RNA，构建了BRD2稳定敲低的H1299-shBRD2和Vero-shBRD2细胞系及其对照细胞系。细胞增殖实验显示，敲低BRD2对H1299细胞的增殖活性无显著影响，但使Vero细胞的增殖活性略有降低。病毒感染实验表明，在BRD2敲低的细胞中，IBV的病毒滴度在细胞裂解液和上清液中均显著高于对照细胞，尤其是在细胞裂解液中差异更为明显，这说明敲低BRD2促进了IBV在细胞内的复制，但对病毒粒子释放的影响相对较小。时序感染的蛋白质印迹分析进一步显示，在敲低BRD2的细胞中，IBV结构蛋白S、N、M的表达更高，并且病毒感染诱导的细胞凋亡也显著增强。通过小分子siRNA进行的BRD2瞬时敲低实验也得到了类似结果，即增强了IBV N蛋白的表达。然而，过表达BRD2对IBV的复制则未产生显著影响。类似的现象也出现在PEDV、HCoV-229E和HCoV-OC43的感染中：在BRD2敲低的细胞中，这些冠状病毒的N蛋白表达均有所增加，并且HCoV-229E和HCoV-OC43感染诱导的细胞凋亡也更为显著。这些结果一致表明，敲低BRD2能增强来自三个不同属的四种冠状病毒的复制，并在多种感染细胞中诱导更强烈的晚期凋亡。尽管BRD2对复制的直接影响较为有限，但它很可能是宿主支持病毒适应性网络中的一个组成部分，其个体贡献或许微妙，但集体作用重要。这一模型与BRD2-E互作在调节免疫信号传导中可能扮演的主要功能更为吻合。
BRD2促进冠状病毒感染细胞中促炎反应的诱导
BRD2是一种含溴结构域的表观遗传因子，能通过结合相关促炎因子转录本的启动子来促进其mRNA表达。基于已发表的转录组数据及其作为经典BRD2转录靶标的作用，本研究选择了细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α进行分析。在IBV感染的人源HeLa、禽源DF1和猴源Vero细胞中，这三种促炎因子的mRNA在感染晚期被显著诱导上调超过20倍。同时，NF-κB p65和IκBα激酶的磷酸化形式在感染过程中明显增加，IL-6的蛋白表达也显著上调，这表明IBV感染激活了NF-κB信号通路并诱导了促炎细胞因子的表达。在IBV感染的BRD2敲低细胞中，病毒基因组RNA和亚基因组RNA的检测量显著增加，证实病毒复制增强，而IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA水平则显著降低。值得注意的是，在BRD2敲低的细胞中，BET家族其他成员（如BRD3、BRD4和BRDT）的转录水平却显著升高，提示BET家族基因间可能存在功能补偿机制。类似的模式也在PEDV、HCoV-229E和HCoV-OC43的感染中被观察到：BRD2敲低增强了病毒复制，同时降低了促炎细胞因子的诱导。这些结果共同证明了BRD2在促进冠状病毒感染细胞中病毒复制和炎症反应方面的功能参与。
BRD2蛋白促进NF-κB信号通路的激活及促炎因子的表达
作为功能缺失实验的补充，研究人员在H1299细胞中过表达了BRD2，然后分别用IBV和HCoV-OC43进行感染。结果显示，过表达BRD2增强了感染细胞中NF-κB p65、IκBα及其磷酸化形式的蛋白表达水平。同时，在感染了IBV、PEDV、HCoV-229E和HCoV-OC43的H1299细胞中，IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA水平也显著升高。在过表达BRD2的感染细胞中，其他BET家族基因的转录水平则呈现不同程度的变化，提示存在复杂的调控网络。此外，研究还探讨了BRD2和E蛋白对促炎反应的共同影响。在293T细胞中共表达BRD2和IBV E蛋白，并分别用Toll样受体激动剂poly(I:C)和LPS处理，发现无论是单独过表达BRD2或IBV E蛋白，还是两者共表达，均能显著增加IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平。尤为重要的是，共表达BRD2和IBV E蛋白的细胞，其促炎因子表达水平显著高于单独过表达任一蛋白的细胞。这证明BRD2蛋白与IBV E蛋白的相互作用，在促进相关促炎因子的诱导方面发挥了协同增效作用。
综上所述，本研究系统阐释了宿主表观调控因子BRD2与冠状病毒E蛋白之间的直接相互作用，及其在调控病毒复制和宿主促炎反应中的双重功能。一方面，BRD2通过其经典的核内功能，可能结合促炎细胞因子基因启动子上的乙酰化组蛋白，或通过与乙酰化的NF-κB/RelA相互作用，放大NF-κB信号，从而上调IL-6、IL-8、TNF-α等关键促炎介质的转录。另一方面，病毒E蛋白通过与BRD2的BDII结构域结合，导致部分BRD2从细胞核转位至细胞质，并与病毒粒子产生松散关联。二者在胞质内的互作进一步协同，加剧了NF-κB通路的激活和促炎反应，这可能是导致严重冠状病毒感染中细胞因子风暴的重要机制之一。同时，敲低BRD2反而促进了多种冠状病毒的复制并增强了晚期细胞凋亡，揭示了BRD2在宿主抗病毒反应中的复杂角色。这些发现不仅深化了对冠状病毒免疫致病机制的理解，更将BRD2确立为一个潜在的、通用的抗冠状病毒治疗靶点。未来针对BRD2或其与冠状病毒E蛋白相互作用的干预策略，可能为缓解严重感染及其引发的过度炎症提供新的治疗途径。
