《Microbiology Spectrum》：Dissecting the effect of single- and co-infection of TB and COVID-19 pathogens on the sputum microbiome
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这篇研究首次系统性剖析了结核病（TB）与新冠肺炎（COVID-19）共感染（TBCOVID）对患者呼吸道微生物组的协同影响。通过宏基因组和全基因组测序（WGS）分析，文章揭示了共感染状态下特定菌种（如Capnocytophaga gingivalis）及代谢通路（如肺表面活性脂质代谢通路）的显著改变，并发现了与不良治疗结局相关的呼吸道病原体（如嗜麦芽窄食单胞菌）。该研究为理解双重感染的微生物学机制、推动基于共病原体分析的个体化结核治疗方案提供了新的见解。
样本采集与研究方法概述
研究设计为一项横断面研究，共收集了来自四组参与者的痰液样本：仅感染结核分枝杆菌的结核病（TB）组、仅感染SARS-CoV-2的新冠肺炎（COVID）组、TB与COVID-19共感染（TBCOVID）组以及未感染对照组（Control）。通过倾向评分匹配（PSM）方法，从各组中系统性地筛选出子集样本（TB、TBCOVID、Control组各24例，COVID组10例）用于后续分析。所有样本均进行了16S rRNA（V3-V4区）宏基因组测序，并对部分TB和TBCOVID阳性样本进行了结核分枝杆菌全基因组测序（WGS）。生物信息学分析流程包括数据质量控制、扩增子序列变异（ASV）鉴定、基于人类口腔微生物组数据库（HOMD）的分类学注释、使用PICRUSt2进行功能通路预测，以及采用多种统计方法（如ANCOM-BC、LinDA、corncob）进行差异丰度（DA）分析。
测序质量评估与微生物组成特征
通过对技术重复样本的分析，证实了测序数据具有较好的可靠性，属水平读长计数相关系数至少为0.88，香农多样度的组内相关系数（ICC）为0.67。结核分枝杆菌（M. tb）的读长计数在TB和TBCOVID组中显著高于Control和COVID组，且与痰涂片镜检的疾病严重程度（涂片阳性等级）呈正相关，验证了测序的准确性。在物种多样性方面，各疾病组与对照组在α多样性（如观察到的物种数、香农指数、辛普森指数）上无显著差异。然而，基于Bray-Curtis相异度的β多样性分析（PCoA）和PERMANOVA检验显示，在物种水平上，Control组与TB组、Control组与TBCOVID组、以及TB组与TBCOVID组之间的微生物组成存在显著差异，而Control组与COVID组之间则无显著差异。这表明，与单一感染相比，TB与COVID-19共感染导致了独特的呼吸道微生物群落结构。
疾病组与对照组间的差异微生物
与Control组相比，TB和TBCOVID组在属和种水平上均显示出特定的微生物富集或耗竭模式。例如，Prevotella（普雷沃菌属）和Mycobacterium（分枝杆菌属）在TB和TBCOVID组中均显著富集。在物种层面，Prevotella melaninogenica（产黑普雷沃菌）在两组中均富集，而Prevotella pallens（苍白普雷沃菌）仅在TB组中富集。机会性病原体Megasphaera micronuciformis（小核酸巨球形菌）在TB组中富集，与呼吸道感染相关。此外，Alloscardovia omnicolens在TB和COVID组中富集，该菌曾被报告为疑似结核患者脓胸的致病菌。COVID组中则观察到Oribacterium asaccharolyticum、Neisseria oralis等物种的耗竭，这可能与疾病本身或样本量较小有关。
COVID-19共感染对结核病患者微生物组的特异性影响
这是本研究的核心。对比TB组与TBCOVID组，旨在剖析COVID-19对TB患者呼吸道微生物组的叠加效应。
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物种水平的变化：在TBCOVID组中，有四个物种显著富集：Veillonella parvula（极小韦荣球菌）、Prevotella melaninogenica、Escherichia coli（大肠杆菌）和Capnocytophaga gingivalis（牙龈二氧化碳嗜纤维菌）。值得注意的是，Capnocytophaga gingivalis仅在TBCOVID组中被检测到，该菌与口腔鳞状细胞癌肿瘤生长及COVID-19患者暴发性脓毒症相关。同时，Lancefieldella parvula、Prevotella pallens等物种在TBCOVID组中呈现耗竭。这些发现表明，COVID-19共感染可能促使TB患者的呼吸道微环境向更有利于致病性或促炎性细菌定植的方向发展。
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功能通路水平的改变：功能富集分析（PICRUSt2）揭示了TBCOVID组有30条微生物代谢通路显著上调。这些通路主要涉及氨基酸生物合成（如L-甲硫氨酸、L-精氨酸相关通路）、核苷酸代谢（如NAD生物合成I）、碳代谢（如三羧酸循环、磷酸戊糖途径）以及脂质代谢。尤为重要的是，与肺表面活性物质代谢密切相关的肺表面活性脂质代谢通路在TBCOVID组中表现出高达7.46倍的富集倍数。此外，多条胞苷二磷酸-二酰甘油（CDP-DAG）生物合成通路也显著上调，这些通路在细菌磷脂合成中起关键作用。进一步分析发现，病原体如Stenotrophomonas maltophilia（嗜麦芽窄食单胞菌）、Haemophilus parainfluenzae（副流感嗜血杆菌）以及M. tb、Prevotella melaninogenica、Escherichia coli等是这些上调通路的主要贡献者。这提示共感染可能通过改变关键病原体的代谢活动，影响肺部脂质环境，进而加剧肺部的病理状态。
结核分枝杆菌基因组分析
对TB组和TBCOVID组子集样本的结核分枝杆菌进行全基因组测序（WGS）和变异分析，使用Demixer和TB-Profiler工具进行菌株分型和耐药突变检测。分析显示，两组样本的结核分枝杆菌主要属于谱系1，在系统发育树上没有形成与疾病分组（TB vs. TBCOVID）相关的特定聚类，也未发现两组间存在显著的遗传组成差异。这表明，在共感染期间，COVID-19并未对结核分枝杆菌的基因组构成产生可检测的短期影响，这可能与结核分枝杆菌进化缓慢，而COVID-19感染病程相对较短有关。
微生物通路与临床结局的关联及个体化治疗启示
研究超越组间比较，进行了个体样本水平的聚类分析。基于TBCOVID组中上调的30条通路活性，对所有TB和TBCOVID患者进行层次聚类，主要形成了两个集群：集群1以TB患者为主（70%），集群2以TBCOVID患者为主（75%）。通过关联数年后的临床随访数据（来自印度的Nikshay患者追踪系统），研究者定义了“不良结局”，包括多次结核发作、耐药、治疗失败或死亡。分析发现，集群2中有7名患者出现不良结局，高于集群1的3名。在集群2中，识别出一个由三名均经历多次结核发作的患者（SM026, SM038, SM048）组成的亚集群，其通路活性更强。值得注意的是，其中两名患者（SM026, SM048）的痰液微生物组中检出了呼吸道病原体Stenotrophomonas maltophilia。该菌是多重耐药的机会性病原体，与不良治疗结局相关。此外，整个集群2中检测到的呼吸道病原体（包括Stenotrophomonas maltophilia、Acinetobacter baumannii等）数量是集群1的两倍。这强烈提示，在结核病治疗中，识别并靶向这些共存的呼吸道病原体，进行抗生素方案的个性化调整，可能改善这部分高危患者的治疗结果。
研究意义与展望
本研究首次从微生物组角度深入探讨了TB与COVID-19共感染的相互作用。主要发现包括：共感染导致了独特的呼吸道微生物群落失调，富集了如Capnocytophaga gingivalis等特定病原体；上调了与肺部脂质代谢和细菌生存密切相关的微生物功能通路；并通过聚类分析将特定的微生物通路特征与不良临床结局、共存病原体联系起来。这些发现凸显了利用宏基因组测序进行结核病诊断和共感染病原体检测的潜力，并为开发基于微生物组特征的个性化治疗策略提供了新思路。研究的局限性包括样本量相对较小、COVID组和Control组协变量信息不全、缺乏治疗后的纵向数据等。未来需要在更大规模、多中心的前瞻性队列中验证这些发现，并通过实验研究明确关键菌种及其代谢通路在共感染病理过程中的具体作用机制。
