《mSystems》：Salt supplementation-induced metabolic reprogramming in Streptomyces coelicolor
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本研究揭示了盐分（100 mM NaCl）如何作为关键环境信号，在天蓝色链霉菌（S. coelicolor）中诱导广泛的重编程，从离子和相容性溶质摄取、磷酸盐限制应激，到能量代谢，最终协同激活了包括十一烷基灵菌红素和Coelimycin P1在内的多种次级代谢物的生产。这项工作系统地阐明了链霉菌如何应对盐胁迫并“定制”细胞代谢以适应次级代谢，为理解这类重要工业微生物的代谢调控机制铺平了道路。
盐分补充诱导次级代谢物生产
许多细菌，包括模式生物天蓝色链霉菌A3(2)，会响应外部刺激（如温度变化、抗生素存在以及其他生物的存在等非生物胁迫）而产生不同的次级代谢物。然而，这些刺激通常难以预测。为了识别能促进次级代谢物生产的环境条件，我们在32种不同的培养条件下培养了天蓝色链霉菌M145（无质粒菌株），并在不同时间点采样。尽管已知ISP-2培养基能促进天蓝色链霉菌中包括十一烷基灵菌红素在内的色素次级代谢物的生产，但通常需要较长的培养时间。我们筛选了能在4天内增强培养基色素沉着的条件。在测试的32种条件中，补充盐分（添加100 mM氯化钠）的条件最能显著诱导培养液呈现红色色素沉着，表明有十一烷基灵菌红素产生。选择相对较低的100 mM浓度，是为了确保在相同时间点下不同条件间的生长阶段相似，因为先前使用更高浓度（500 mM–1000 mM）盐分补充条件的研究显示出延迟生长或细胞分化。尽管如此，这个浓度足以改变色素沉着的程度。培养液上清的分光光度分析显示，盐分补充条件增加了包括540 nm（十一烷基灵菌红素的最大吸收波长）在内的一系列波长的吸收。这些观察结果表明，盐分补充诱导了包括十一烷基灵菌红素在内的多种代谢物的产生。
通过增加盐度鉴定过量生产的次级代谢物
由于盐分补充增加了包括十一烷基灵菌红素在内的代谢物产量，我们通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行了比较代谢组学分析，以鉴定由盐度增加而过量生产的次级代谢物。在三个时间点（0.5小时、48小时和96小时）收集培养液上清，用乙酸乙酯提取，并通过LC-MS在正离子和负离子模式下进行分析。对LC-MS数据进行非靶向分析和GNPS质谱谱库搜索，揭示了几种已知次级代谢物的生产。其中包括杀菌孢菌素，但其生产水平并未因盐度增加而可检测地受到影响。随后的统计分析显示，在正离子和负离子模式下，分别有161个和123个LC-MS特征被确定为差异产生或消耗。与吸收光谱数据一致，十一烷基灵菌红素在高盐度条件下与streptorubin B（十一烷基灵菌红素的环化衍生物）一起更大量地产生。此外，coelimycin P1的生产也更活跃。而且，在盐分补充条件下，有几种多环化合物积累得更多。其中之一是橙皮素，这是一种由III型聚酮合酶（PKS）产生的黄酮类化合物。此外，已知的放线紫红素生物合成的分流产物及其衍生物，如SEK-4b和dehydromutactin，在盐度增加的条件下过量产生。因此，我们对LC-MS数据进行了靶向分析，以确定放线紫红素的生产。有几个峰的质量与放线紫红素及其衍生物（包括放线紫红素的胞外形式和放线紫红素生物合成的最终产物γ-放线紫红素）的理论质荷比相匹配。与放线紫红素生物合成分流产物的积累一致，这些推定的放线紫红素特征的质谱信号在盐度增加条件下更高，表明放线紫红素生物合成增强。总体而言，我们的代谢组学数据表明，盐度增加激活了几种次级代谢物的生产。
盐分补充诱导的差异基因表达
为了更好地理解盐度增加引起的生理变化，我们进行了转录组学分析。由于某些代谢基因的转录可能是暂时的，并且可能与代谢物积累的时间不匹配，因此分析了3个时间点（0.5小时、24小时和48小时，其中包括比代谢组学分析所用更早的时间点）的转录组。接种到主培养物中的预培养样品被用作参考条件（时间0）。基因片段计数的相关性分析显示重复样本之间聚类和高皮尔逊相关系数，表明重复样本间具有高度可重复性。相对于参考条件的log2转换倍数变化用于进一步分析。如果错误发现率调整后的P值大于或等于0.05，则将log2转换倍数变化设置为0（无变化）。如果一个基因在7种条件（3个时间点有或无氯化钠，加上参考条件）中的最高和最低表达水平之间的倍数变化达到5倍或更高，则认为该基因差异表达。共有894个基因满足此标准，被视为差异表达基因。与天蓝色链霉菌基因组所包含的所有基因相比，差异表达基因的保守程度较低，这表明盐分补充除了影响保守通路外，还影响了物种或菌株特异性的生物过程。我们进行了Fisher精确检验，以确定差异表达基因中过度富集的功能类别。使用EggNOG分配的功能类别，属于“能量产生与转换”、“防御机制”、“无机离子转运与代谢”、“次级代谢物生物合成、转运与分解代谢”以及“细胞壁/膜/包膜生物合成”的基因被富集了1.4-1.6倍。大多数差异表达基因主要受盐度增加的影响，但仍有一些基因的表达模式主要是生长阶段依赖性的，与盐浓度无关。例如，许多编码核糖体蛋白的基因在0.5小时时在两种条件下都高表达。同样，大多数参与硝酸盐还原用于厌氧呼吸的基因在生长开始时高表达。此外，编码一氧化氮（NO）传感器转录因子的nsrR（SCO7427）被上调，表明在指数期一氧化氮向铵的活跃转化。虽然这些基因的表达在较晚时间点（24小时和48小时）下降，但与盐浓度无关，但它们的表达水平在盐分补充条件下略高。这些数据表明，细胞在盐分补充条件下维持了相对较高的代谢活性水平，特别是厌氧呼吸，这可能反映了盐分补充培养基中可能的溶解氧减少。在两种条件下，有几个基因在较晚时间点表达增加。我们推测其中一些基因参与适应稳定期环境的通路。例如，包括lsr2和wblC在内的几个转录因子基因被上调。然而，许多生长阶段依赖性基因的功能尚未明确确定或预测。
为了找出转录因盐度增加而增强的基因，比较了盐分补充条件下3个时间点之间的最高转录水平与无盐补充条件下3个时间点之间的最高转录水平。如果这个倍数变化达到5倍或更高，我们认为一个基因的转录更活跃。在894个差异表达基因中，有306个基因被确定为在高盐度条件下表达更高，而有11个基因在未补充盐时表达更活跃。这些基因的保守程度甚至更低。然后，我们将差异表达基因映射到天蓝色链霉菌的共识基因组尺度代谢模型中。在该代谢模型中，894个差异表达基因中有262个基因。盐分补充条件诱导了代谢模型中107个基因的表达，而当未添加盐时，只有3个基因高表达。在以下小节中，我们重点关注那些表达水平因盐度增加而改变的基因。
钾离子摄取
许多细菌在暴露于高渗透压（包括盐度胁迫）时会从环境中摄取钾离子，以避免细胞脱水。事实上，先前在灰色链霉菌和加利福尼亚链霉菌中观察到通过增加盐浓度导致的钾离子积累。天蓝色链霉菌编码18个预测属于钾摄取相关蛋白家族之一的蛋白质。其中，SCO7660是盐分补充条件下上调最显著的基因。该基因编码一个经过生化表征的阳离子通道KcsA。先前的生化和结构研究表明，KcsA含有聚磷酸盐和聚[(R)-3-羟基丁酸酯]，在pH >7时优先转运二价阳离子如镁离子和钙离子，在pH <7时转运钾离子。然而，其生理作用尚未被研究。此外，编码阳离子/H+反向转运蛋白的SCO3602也强烈上调。有趣的是，其相邻基因也编码属于钾摄取蛋白家族之一的蛋白质（SCO3601和SCO3609）或包含可能参与钾摄取的蛋白质结构域（SCO3603含有阳离子/H+交换器结构域和K+电导调节C端结构域）。其中，SCO3603被上调。这些基因的上调强烈表明，天蓝色链霉菌细胞响应盐度增加而摄取阳离子，很可能是钾离子。有趣的是，SCO3602的同源物在分析的205个链霉菌物种中的146个基因组中编码，而KcsA仅在7个物种中保守。可能是SCO3602及其周围基因负责多种链霉菌物种的钾摄取，而KcsA仅为天蓝色链霉菌及其近缘物种提供了额外的钾或其他阳离子摄取系统。
出乎意料的是，编码大肠杆菌KdpFABC同源物的转录单位SCO3716–SCO3719主要被下调。KdpFABC复合物在大肠杆菌中利用ATP将钾离子泵入细胞。这一观察表明，在本研究使用的条件下，KdpFABC同源物不太可能是钾离子的主要转运蛋白。
氨基酸摄取和相容性溶质生产
除了钾摄取，细菌在渗透胁迫下还会导入或合成相容性溶质，如甘氨酸甜菜碱。事实上，先前的研究表明，天蓝色链霉菌在响应盐度胁迫时会积累含有甘氨酸和脯氨酸的小肽。转录组数据显示，在0.5小时盐分补充后，苏氨酸通过SCO6799和SCO6800催化转化为甘氨酸（经由2-氨基乙酸盐）的其中一条通路上调。此外，编码枯草芽孢杆菌甘氨酸甜菜碱转运蛋白OpuA同源物的基因也被上调。这些数据表明，天蓝色链霉菌激活甘氨酸积累以对抗盐度增加。有趣的是，参与脯氨酸生物合成的基因的转录未检测到受盐分补充的明显影响。目前尚不清楚在本研究使用的条件下脯氨酸积累是否也被激活。
先前的研究也显示了细胞内外etoine积累的增加及其作为相容性溶质在盐和热胁迫保护中的作用。etoine生物合成基因簇（BGC）中的基因在盐分补充条件下的较早时间点表达相对较高。我们的代谢组学分析主要从培养液上清中检测疏水性化合物，未能检测到etoine及其衍生物的胞内积累。考虑到该BGC在链霉菌基因组中的高度保守性以及已知的etoine作为相容性溶质的功能，增强etoine BGC的表达可能是链霉菌属内的保守反应。比较在本研究条件下盐度增加对etoine数量的影响是很有趣的。总体而言，我们的数据支持加速相容性溶质生产代谢以对抗盐度增加的可能性。
磷酸盐限制胁迫响应基因
基因集富集分析中高度富集的COG类别之一是“无机离子转运与代谢”。属于该类别的许多基因参与磷酸盐摄取和利用。最明显的是，编码高亲和力磷酸盐转运系统的pstSCAB操纵子高度表达（在48小时时>10倍）。已知pstSCAB操纵子直接由双组分反应调节因子PhoP激活。与这一观察一致，PhoP的其他主要靶基因，如壁磷壁酸-细胞壁生物合成基因（SCO4873–SCO4882），在盐分补充条件下高度表达。PhoP活性通过磷酸化被控制，这是由PhoR响应磷酸盐限制催化的。由于PhoP活性可能是磷酸盐限制的指示，我们测量了培养基中的磷酸盐浓度。在不补充盐的情况下，磷酸盐浓度在24小时内从约1.6 mM降至约0.4 mM，并在96小时内逐渐降至约0.3 mM。盐度增加加速了磷酸盐从培养基中的消耗，在96小时内降至<0.02 mM。因此，加速的磷酸盐消耗很可能诱导了磷酸盐限制响应并激活了PhoP调节子。
然后，我们想知道加速的磷酸盐消耗是否是多种链霉菌物种的常见现象。因此，我们在有或无盐补充的ISP-2培养基中培养了三种不同的链霉菌物种：Streptomyces griseofuscus、Streptomyces venezuelae和Streptomyces rimosus，并随时间测量磷酸盐浓度。有趣的是，在这些培养物中，磷酸盐消耗速率并未因盐分补充而发生明显变化。在整个生长过程中，S. rimosus培养物中的磷酸盐浓度几乎恒定。S. rimosus培养物中未检测到磷酸盐消耗有些出乎意料，这可能表明使用了培养基中存在的其他磷酸盐来源（如维生素和磷脂），或者更有效地重复利用或回收代谢物。尽管如此，这些结果表明，盐分补充加速磷酸盐消耗不太可能是多种链霉菌物种的常见响应机制。这些结果也确保，培养基上清中加速的磷酸盐消耗不太可能是测量误差或盐浓度增加导致磷酸盐溶解度变化的结果。加速磷酸盐消耗的可能原因将在讨论部分讨论。
能量生产
另一个高度富集的COG类别是“能量产生与转换”。差异表达的基因组位点之一是nuo基因簇，它编码NADH脱氢酶复合物I，催化氧化磷酸化的第一步，为呼吸链提供电子。在该基因簇的14个基因中，有10个基因在盐分补充条件下表达更活跃。有趣的是，我们注意到前6个基因的反义转录，这可能影响这些基因的翻译。当未补充氯化钠时，反义转录更活跃，可能表明盐分补充减少了nuo基因的翻译调控。我们想知道nuo基因簇的差异表达是否由磷酸盐消耗引起。因此，我们分析了不同磷酸盐浓度培养物的转录组数据。许多nuo基因在磷酸盐可用性降低时表达更高，包括反义转录，表明磷酸盐限制诱导了表达。
此外，编码细胞色素c氧化酶（cox）和还原酶（qcr）的基因转录更活跃。与nuo基因簇不同，这些基因在磷酸盐限制条件下并未高表达。最后，F型ATP合酶基因在整个盐度增加条件下的生长过程中活跃转录，而只有在未补充盐的早期时间点，它们的表达水平才高。F型ATP合酶催化从ADP和磷酸盐合成ATP。与cox和qcr基因类似，ATP合酶基因并未因磷酸盐限制而差异表达。总体而言，各种参与氧化磷酸化以产生ATP的基因因盐度增加而高表达。然而，只有nuo基因簇的表达可能是由盐度增加导致的磷酸盐限制诱导的。
次级代谢
转录组学数据显示，各种参与次级代谢的基因差异表达。与代谢组学数据一致，coelimycin（cpk）和十一烷基灵菌红素（red）生物合成基因簇（BGC）在盐分补充条件下转录更活跃。cpk BGC还编码SCB生物合成所需的酶（ScbA）。正如预期，与SCB-1、SCB-2和SCB-3理论质荷比匹配的质谱信号响应盐度增加而增加。另一个高表达的BGC是cda，负责钙依赖性抗生素的生物合成。然而，可能是由于其相对较高的亲水性，代谢组学分析未能检测到钙依赖性抗生素。有趣的是，放线紫红素BGC（act）的表达在盐度增加条件下的24小时被抑制，随后在48小时被激活，但程度较低。实际上，对应于放线紫红素的质谱信号相对于coelimycin P1和十一烷基灵菌红素较小。act BGC的延迟和相对较低的激活可能导致放线紫红素生产的激活减弱。PhoP对这四种BGC的直接调控仍然存在争议，因为各种研究显示出矛盾的结果。我们分析了磷酸盐限制条件下转录组数据的表达水平。与我们的数据相反，cpk BGC在磷酸盐限制条件下被抑制，而red BGC未检测到受影响。act BGC在磷酸盐限制条件下被更高程度地激活，而cda BGC的激活更有限。因此，磷酸盐消耗不太可能直接导致red和cpk表达的激活，尽管它可能仍然有助于act和cda的激活。
出乎意料的是，两种铁载体BGC，cch和des，因盐度增加而下调。铁依赖性调节因子DmdR1直接控制两种BGC的转录以及位于des BGC外部的desJGH操纵子。后三个基因中的desG和desH被下调，表明铁载体生产和铁摄取减少。盐度增加如何影响铁摄取和利用仍有待揭示。
Coelimycin、十一烷基灵菌红素和放线紫红素的生物合成（均为聚酮化合物）需要丙二酰辅酶A作为生物合成底物。丙二酰辅酶A由乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶催化下合成。天蓝色链霉菌编码一个必需的乙酰辅酶A羧化酶α亚基和一个β亚基，分别为AccA2和AccB，它们是脂肪酸生物合成所必需的。此外，天蓝色链霉菌编码第二个α亚基拷贝AccA1和一个可能的β亚基CpkK。虽然必需亚基基因没有显著差异表达，但这些额外的拷贝因盐度增加而大幅上调。accA1和cpkK都位于cpk BGC内。尽管脂肪酸生物合成与聚酮化合物生物合成竞争，因为两种途径都使用丙二酰辅酶A作为底物，但编码脂肪酸生物合成酶的基因并未上调，这表明为了聚酮化合物生产而增强了丙二酰辅酶A的生物合成。与cpk BGC中的大多数基因不同，AccA1和CpkK与CpkPα和CpkPβ一起在链霉菌物种中高度保守。尽管CpkPα和CpkPβ的实际功能尚不清楚，但推测它们参与乙酰辅酶A的生产。确定这些保守基因的同源物是否通过增加盐度而高表达以提供丙二酰辅酶A并增强其他链霉菌物种的聚酮化合物生产，是很有趣的。
聚酮合酶（PKSs）和非核糖体肽合成酶（NRPSs）通过辅酶A的磷酸泛酰巯基乙胺基侧链掺入其酰基载体蛋白（ACP）或肽基载体蛋白（PCP）结构域而被激活，这是由磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（PPTase）催化的。天蓝色链霉菌编码三个PPTase基因：acpS、redU和SCO6673。虽然AcpS是必需的，并激活脂肪酸合酶和放线紫红素合酶ACP，但RedU和SCO6673激活十一烷基灵菌红素合酶ACP和钙依赖性抗生素合成酶PCP。在盐度增加条件下，redU和SCO6673都高表达，而acpS的转录水平未显示任何可检测的变化。
次级代谢通常由位于BGC外部的各种转录因子控制。其中之一是AfsS，它是一个多效性调节因子，可增强red和act BGC的表达，尽管AfsS的靶基因以及AfsS如何激活这些BGC仍然未知。afsS的转录被AfsR激活，AfsR的活性需要AfsK催化的磷酸化。在盐分补充条件下，afsS的转录增强，而对afsR转录的增强程度较小。afsK的转录未检测到受影响。已知AfsK的活性受自磷酸化控制，随后通过磷酸化激活AfsR。盐度增加很可能诱导AfsK的自磷酸化，磷酸化的AfsR激活afsS转录。NsdA和NsdB对多种次级代谢物的生产产生负面影响，尽管调节的实际机制尚不清楚。在盐度增加条件下，nsdA和nsdB的转录在24小时被抑制，这可能额外增强了次级代谢物的生产。
除了BGC编码序列的差异表达外，我们观察到hopene BGC的反义转录。值得注意的是，反义转录的水平在盐度增加条件下降低。虽然反义转录的实际作用各不相同，但许多被推测为负向控制互补正义转录的稳定性或翻译。已知hopene可降低膜通透性，可能是作为一种胁迫响应。有人提出，hopene在天蓝色链霉菌形态分化过程中减少菌丝的水分渗透性。很可能hopene的生产因盐度增加而增强，可能是为了减少水从细胞中扩散。
我们注意到SCO5746的激活表达，它编码3-氨基-5-羟基苯甲酸（AHBA）合酶。该酶催化AHBA生物合成的最后一步。AHBA是几种链霉菌物种产生的多种次级代谢物（如利福霉素和丝裂霉素）的前体。天蓝色链霉菌基因组中的这个基因不与任何可能参与次级代谢物生物合成的基因共定位，有趣的是，它位于一个5S rDNA基因和一个tDNA基因之间。该基因在低磷酸盐条件下也高表达，表明加速的磷酸盐消耗增强了SCO5746的表达。迄今为止，尚未从天蓝色链霉菌中发现AHBA衍生的次级代谢物。对这些生长条件的进一步研究可能揭示AHBA在天蓝色链霉菌中的作用。
总体而言，转录组数据表明，天蓝色链霉菌在盐度增加时激活了涉及生物合成、前体供应、PKS和NRPS的翻译后修饰以及调节的基因表达，以增强次级代谢物的生产。
细胞壁生物合成
各种已知参与细胞壁生物合成的基因差异表达。这些基因包括壁磷壁酸-细胞壁生物合成基因簇（SCO4873–SCO4882），它受PhoP控制。此外，cwg操纵子的第一个基因cwgA及其反向转录的基因SCO6178被激活。后一个基因编码一种糖苷水解酶，可能修饰肽聚糖成分。已知cwg和SCO6178都直接受细胞包膜胁迫响应σ因子σE控制。然而，在本研究使用的条件下，sigE基因未被上调。由于已知SigE活性在转录阶段通过条件性激活sigE表达来控制，因此仍需确定这些SigE靶基因的转录如何在盐度增加条件下被激活。此外，编码D-Ala-D-Ala二肽酶的SCO1396也被上调。与壁磷壁酸-细胞壁生物合成基因不同，cwg操纵子和SCO1396不受磷酸盐限制影响。盐度胁迫引起的细胞壁性质变化是其他细菌中的已知现象。我们的数据表明，细胞壁重塑很可能在响应盐度增加时发生，部分由磷酸盐限制诱导。
转运蛋白
除了上述基因外，几个编码ABC转运蛋白的基因响应盐分补充而差异表达。虽然许多转运蛋白的底物了解甚少或难以预测，但也有一些明显的例外。由PhoP激活的Pst转运蛋白负责在磷酸盐限制时摄取磷酸盐。另一种预测与磷酸盐结合的转运蛋白SCO2428也被上调，尽管先前未提及它参与磷酸盐限制胁迫响应。磷酸盐限制胁迫的转录组数据也显示SCO2428上调，表明其表达被磷酸盐限制胁迫诱导。另一种转运蛋白SCO5035预测转运脂蛋白。如上所述，甘氨酸/甜菜碱转运蛋白基因SCO1620和SCO1621活跃表达。此外，一个推定的甲硫氨酸转运蛋白基因SCO1557被激活。相比之下，多胺转运蛋白基因（SCO5667–SCO6570）和二肽转运蛋白基因（SCO5476–SCO5480）被部分下调，尽管这些代谢物的作用尚不清楚。
在我们的转录组和代谢组分析中，使用了复合培养基ISP-2。该培养基除了葡萄糖外，还含有酵母提取物和麦芽提取物，其中包含各种氨基酸。由于已知小肽在盐度胁迫响应中的作用，激活各种转运系统以从
