DNA连接酶1 K845N变异体：通过提高连接保真度、抑制体细胞CAG重复扩展延缓亨廷顿病进程

本研究发现，亨廷顿病（HD）修饰基因LIG1的罕见错义变异K845N，通过提高DNA连接酶1对错配底物的识别能力（增加修复保真度），抑制了HTT基因CAG重复序列的体细胞扩展，并在氧化应激条件下增强细胞存活、降低基因组突变频率，从而延缓了HD发病。这项研究为DNA连接酶保真度作为治疗靶点提供了机制基础。

　　

LIG1 K845N在体外对错配底物显示出降低的连接酶活性，且对连接环境（特别是致突变性的3‘端错配）敏感。

LIG1 K845N变异体在保守的寡核苷酸结合折叠结构域内，以一个带正电荷的赖氨酸取代了极性的天冬酰胺，该结构域对DNA结合和定位至关重要。通过凝胶DNA连接实验比较了全长LIG1野生型和K845N的体外连接酶活性。使用带有不同3‘端核苷酸的经典切口DNA底物，在标准连接酶测定缓冲液中进行检测。结果显示，对于dA:dT（A:T）底物，两者均有催化活性。然而，当使用3’ C:G底物时，K845N的连接酶活性有轻微但显著的下降。在测试所有12种可能的3‘-OH端错配时，K845N变异体在所有错配底物上均未检测到连接活性，而野生型LIG1在G:T、C:T、T:C、T:G、C:A和A:C错配上表现出微弱但可检测的活性。对于其余六种碱基组合，野生型显示很少或无连接酶活性，K845N也未检测到活性。这表明K845N对所有测试底物的连接酶活性均降低，但这种缺陷对错配底物不成比例地更大，导致对致突变性切口的连接几乎完全抑制。此外，在3’ 8-氧代鸟嘌呤:腺嘌呤（8-oxoG:A）这种常见的氧化应激下形成的致突变性底物环境中，K845N也显示出比野生型降低的连接活性。对复制错误（如错配）或氧化核苷酸池中掺入的8-氧代-dGTP连接活性的降低，可能提高基因组维持的整体保真度，支持K845N的保护功能。

K845N选择性中止8-oxoG:A错配的连接以增强连接保真度。

为了阐明K845N取代如何改变LIG1的生化特性，研究人员在先前研究其他LIG1罕见变体相同的条件下，对Δ232 LIG1进行了彻底的动力学表征。活性位点滴定用于确定活性Δ232 LIG1的浓度。差异扫描荧光法显示Δ232 LIG1 K845N具有与野生型蛋白相同的整体稳定性。DNA结合实验发现Δ232 LIG1 K845N与切口DNA底物的亲和力与野生型相同。随后使用稳态动力学研究了Δ232 LIG1变体的催化活性。代表性时间进程显示，与在较高Mg²⁺浓度和不同序列背景下观察到的全长LIG1结果相似，K845N在未损伤底物上活性降低，在8-oxoG:A底物上活性大幅降低。通过高分辨率测序凝胶，可以分辨出在8-oxoG:A底物反应中特别普遍的流产AMP-DNA物种与未反应底物。接下来测量了在DNA饱和浓度（1000 nM）下的初始连接速率。数据显示，K845N催化的反应中密封DNA产物的减少伴随着可检测到的AMP-DNA释放量的增加。类似地用8-oxoG:A底物进行的反应显示，野生型LIG1释放的AMP-DNA大致与连接DNA的量相当，而LIG1 K845N主要释放AMP-DNA，未能完成连接反应。研究人员随后测量了经典切口DNA底物在一系列底物浓度下的初始反应速率，并将米氏方程拟合到数据中。推导出的稳态速率常数显示，野生型和K845N的最大速率常数（k_cat）值分别为0.52 ± 0.01 和 0.20 ± 0.01 s^?1（降低了2.6倍）。K_M值K845N比野生型高1.9倍，导致催化效率（k_cat/K_M）降低4.9倍。用8-oxoG:A底物进行的类似实验确定了稳态动力学参数。K845N和野生型在该底物上的连接酶活性存在显著差异，差异主要在于k_cat值（降低25倍）和K_M值的适度增加（2.3倍），对应于k_cat/K_M降低58倍。研究人员量化了每种酶对每种底物的流产连接比例，发现K845N增加了两种底物的流产连接量，其中对8-oxoG:A底物的连接产物比例的减少比对未损伤底物更为显著。流产连接比例增加了1.8倍，对应于8-oxoG:A底物的连接比例相对于野生型酶降低了7.0倍。因此，LIG1 K845N增强的拒绝含8-oxoG:A切口的能力归因于更低的切口密封速率和更高的AMP-DNA流产释放速率。为了量化K845N取代提高LIG1保真度的程度，计算了Δ232 LIG1野生型和K845N区分8-oxoG:A与未损伤切口的歧视因子。与之前的报告一致，LIG1野生型难以区分8-oxoG:A配对与其他沃森-克里克配对的切口，这仅显示出5.1倍的歧视。相比之下，K845N对8-oxoG:A的歧视达到60倍，是野生型LIG1酶保真度的12倍。K845在哺乳动物LIG1同源物中高度保守，这些数据表明K845N取代赋予了独特的生化特性。在对经典底物的连接影响最小的前提下，K845N在防止上游错配连接方面表现出增强的保真度。

携带LIG1 K845N变异体的细胞在氧化应激下表现出更高的存活率和更低的基因组DNA突变。

基于这些生化研究，研究人员假设LIG1 K845N增强的保真度会导致细胞DNA突变率降低，在细胞应激条件下提供生存优势。考虑到先前有数据表明氧化应激是亨廷顿病的潜在贡献因素，他们测试了K845N是否可能保护细胞免受氧化DNA损伤诱导的应激。首先使用了稳定过表达全长LIG1野生型或K845N（表达水平相似）的人胚胎肾（HEK）293细胞。用诱导氧化DNA损伤的8 μM甲萘醌处理细胞，并在处理后立即以及恢复24或48小时后评估细胞活力。处理后立即，转染空载体、表达LIG1野生型或K845N的HEK 293细胞之间的存活率（约66%）没有差异。恢复24小时后，表达LIG1野生型和K845N的细胞显示出比空载体转染细胞略高的存活率。有趣的是，恢复48小时后，表达K845N的细胞显示出比空载体转染或LIG1野生型表达细胞显著更高的存活率。此外，当在不同浓度的甲萘醌处理后恢复48小时评估时，表达K845N的细胞在所有处理条件下都持续表现出更高的存活率，暗示K845N变异体赋予了一种恢复依赖性的抗氧化应激保护效应。为了测试恢复依赖性表型是否反映了DNA连接酶丰度的补偿性变化，研究人员量化了未经处理、甲萘醌处理、无论是否恢复的细胞中LIG1、LIG3和LIG4的蛋白水平，但没有观察到任何显著差异，表明观察到的表型不归因于DNA连接酶表达的改变。此外，表达LIG1野生型或K845N的细胞在细胞生长速率上没有显著差异，表明内在生长速率不影响细胞活力的差异。为了确定仅仅是连接酶活性降低是否驱动K845N存活表型，研究人员测试了催化失活的LIG1突变体K568A。与K845N不同，K568A在甲萘醌处理后没有增加存活率，类似于野生型细胞，表明增强的存活不是由于催化活性丧失，而是反映了保真度依赖的效应。为了直接评估基因组DNA突变率，对表达LIG1野生型或K845N的HEK 293细胞进行了双链测序。研究人员重新优化了条件，以建立一个扩大规模的检测，提供足够的细胞进行双链测序，并确定在这些条件下，表达LIG1 K845N的细胞在用8 μM或20 μM甲萘醌处理并恢复48小时后，表现出显著更高的存活率。对细胞进行分区用于活力测量，并从剩余细胞中提取DNA。进行双链测序以确定突变频率。在表达LIG1野生型和LIG1 K845N的细胞中，突变频率均呈甲萘醌浓度依赖性增加。虽然表达LIG1 K845N的细胞在无处理时基线突变频率略高，但在有甲萘醌存在时突变频率略低。相对于基线（0 μM甲萘醌），甲萘醌浓度和LIG1变异体对突变频率均有显著的主效应。多重比较校正显示，在20 μM甲萘醌时，K845N表达细胞的相对突变频率显著低于野生型表达细胞，在8 μM时也观察到类似趋势。这些结果表明，K845N赋予的细胞活力增加可能部分归因于突变负担的减少，这与K845N增强的保真度一致。为了将这些发现扩展到亨廷顿病患者来源的细胞，研究人员检查了仅携带LIG1rs145821638参考C等位基因的淋巴母细胞样细胞系，或杂合携带19AM3修饰变异A等位基因的亨廷顿病淋巴母细胞样细胞系。用不同浓度的甲萘醌处理亨廷顿病患者来源的LIG1+/+ 和 LIG1K845N/+ 淋巴母细胞样细胞系，与HEK 293细胞一样，在立即、恢复24和48小时后测量活力。虽然LIG1+/+ 淋巴母细胞样细胞系在不恢复的情况下甲萘醌处理后立即表现出活力增加，但LIG1K845N/+ 淋巴母细胞样细胞系在甲萘醌处理后恢复24小时期间显示出比LIG1+/+ 淋巴母细胞样细胞系显著更高的活力。相对于基线，双因素方差分析确定了甲萘醌浓度和K845N基因型对细胞活力均有显著的主效应，且两个因素之间没有显著的交互作用。这表明甲萘醌处理和基因型的影响是相加的，并且两种基因型在增加的甲萘醌浓度下表现出相似的活力反应。多重检验校正后，没有单个基因型比较保持显著，尽管在用21 μM甲萘醌处理时，LIG1K845N/+ 与 LGL1+/+ 淋巴母细胞样细胞系的活力增加幅度最大。48小时后，差异与24小时观察到的相似，但不太明显。考虑到可用的具有K845N变异体的亨廷顿病淋巴母细胞样细胞系数量较少，以及患者样本遗传背景的异质性，淋巴母细胞样细胞系中的统计功效有限。尽管如此，与在HEK 293细胞中的发现一致，LIG1 K845N的保护作用在恢复期后出现，表达内源性LIG1 K845N变异体的亨廷顿病淋巴母细胞样细胞系也表现出恢复依赖性的保护表型。与在HEK 293过表达系统中一样，研究人员观察到LIG1+/+ 和 LIG1K845N/+ 细胞之间的基础增殖率没有差异，并且在未经处理和甲萘醌处理的细胞中，无论是否恢复，LIG1、LIG3和LIG4蛋白水平没有显著差异。

小鼠K845N同源变异体抑制Htt^Q111小鼠的体细胞CAG扩展。

HTTCAG重复的体细胞扩展驱动了亨廷顿病临床表型的发作。年龄依赖性的体细胞扩展可以在Htt^Q111CAG敲入小鼠中轻易测量到，在纹状体和肝脏中均以高速率发生。为了测试与延迟亨廷顿病相关的LIG1错义变异是否影响体细胞CAG扩展，研究人员使用CRISPR-Cas9介导的同源定向修复，将与人修饰突变相同的突变引入小鼠Lig1基因，将LIG1第843位的赖氨酸残基变为天冬酰胺。K845是一个保守残基，表明其在包括小鼠在内的物种间具有功能重要性。研究人员建立了一个Lig1^K843N品系，并将其与Htt^Q111小鼠杂交。Lig1^K843N变异不影响胚胎发育，Lig1^+/+、Lig1^K843N/+或 Lig1^K843N/K843N以预期的孟德尔比率出生，这与Lig1无效等位基因（纯合无效胚胎在E15.5/E16.5后无法存活）形成对比。与Lig1^K843N/K843N小鼠的存活一致，K843N变化没有改变Lig1表达水平。研究人员也没有在Lig1^K843N/+或 Lig1^K843N/K843N小鼠中观察到任何明显表型。这些小鼠没有发展出肿瘤，这与携带LIG1综合征相关R771W点突变的小鼠（在患者细胞中使连接酶活性降低20倍）形成对比。携带Lig1^+/+、Lig1^K843N/+和 Lig1^K843N/K843N基因型的Htt^Q111/+小鼠被饲养以用于体细胞扩展分析。两个最不稳定的组织，纹状体和肝脏的分析显示，在3、6和10个月大时，Lig1^K843N/K843N纹状体中的体细胞扩展显著低于Lig1^+/+纹状体；在6和10个月大时，Lig1^K843N/K843N肝脏中的体细胞扩展也显著降低。扩展在3个月和6个月大时的皮质中也显著降低，在6个月大时的海马体中也显著降低。不同Lig1基因型小鼠队列的遗传重复长度没有显著差异。此外，扩展不受与K843N共引入的沉默原间隔相邻基序突变的影响，这在一个独立携带该突变但不含K843N变化的小鼠品系中得到了验证。在所分析的组织中，LIG1K843N似乎对纹状体的扩展影响最为显著。尽管研究人员观察到了Lig1^K843N等位基因剂量依赖的趋势，但杂合Lig1^K843N/+小鼠相对于Lig1^+/+小鼠的扩展没有受到显著影响。该变异体的影响似乎是中度的，一个变异等位基因使纹状体扩展减少3%至5%，两个突变等位基因使6至10个月大小鼠的扩展减少约15%至16%。总体而言，这些数据支持体细胞扩展减少是LIG1功能改变（由K843N取代引起）的结果。

讨论。

rs145821638的次要等位基因编码LIG1K845N变异体，在全基因组关联研究中被确定为捕获与延迟亨廷顿病临床表型相关的修饰效应的顶级单核苷酸变异。该单核苷酸变异的影响是巨大的，将运动发作延迟了7至8年。这种罕见变异存在于大约每700个个体中，用极性的天冬酰胺取代了寡核苷酸结合折叠结构域内的一个保守赖氨酸，预计会破坏寡核苷酸结合折叠结构域和腺苷酰化结构域之间界面处的氢键相互作用。在本研究中，研究人员通过研究其生化、细胞和分子后果，评估了亨廷顿病修饰效应反映了受此LIG1K845N错义变化直接影响机制的假设。与LIG1综合征相关的双等位基因功能丧失性LIG1错义突变表现出最大速率常数和DNA连接催化效率的降低。相比之下，对全长和Δ232截短形式的LIG1的生化分析揭示，K845N的影响与免疫缺陷综合征相关的LIG1等位基因不同。研究发现K845N在未损伤的切口DNA底物上保持接近正常的连接活性，但在错配底物上表现出降低的活性。这种增强的底物辨别能力，包括对8-oxoG:A碱基对的辨别，突显了K845N作为一种更高保真度的LIG1变体。动力学研究表明，在8-oxoG:A底物上的催化效率（k_cat/K_M）降低了59倍，同时流产连接事件增加。值得注意的是，K845N变异体在错配和正确配对底物之间表现出60倍的歧视，远超野生型的5倍歧视。重要的是，这种歧视的很大一部分表现为对不正确切口的流产连接增加，这将防止另一种连接酶的结合，并确保其他修复过程有额外的时间进行。因此，预计K845N增强的连接保真度会在杂合背景下显现。这在亨廷顿病患者中是相关的，因为显著的临床修饰出现在杂合携带此LIG1变异体的个体中。还应注意，在某些缺乏腺苷酰水解酶的原代神经元中，AMP-DNA中间体具有毒性。考虑到K845N变异体的普遍性，流产连接不太可能压倒腺苷酰水解酶修复大脑中AMP-DNA位点的能力。然而，AMP-DNA中间体在不同细胞环境中如何处理，以及这种平衡如何在从氧化应激恢复期间影响存活，将需要未来的研究。例如，延迟连接可能影响恢复阶段的DNA损伤信号传导。据报道，LIG1与检查点相关复合物相互作用，这可能为修复提供额外时间。K845N取代预计会改变腺苷酰化结构域和寡核苷酸结合折叠结构域之间的界面，预计当LIG1环绕DNA底物时，会稳定其闭合构象。研究人员假设，破坏K845与L750和V753骨架酰胺之间的相互作用将导致灵活性增加，并将结合构象转向更开放的构象，从而允许从AMP-DNA中间体解离。这个概念在示意图中得以说明，其中从错配底物的AMP-DNA中间体解离增加为增强的连接酶保真度提供了基础。在测试条件下，K845N保留了足够稳定的闭合复合物，使得从匹配底物的解离最小，仅观察到催化效率的适度降低。在功能上，这种保真度的增强转化为细胞检测中可测量的益处。表达LIG1 K845N的HEK 293细胞在用氧化损伤药物甲萘醌处理后，表现出比表达LIG1野生型的细胞显著更高的存活率。值得注意的是，这种保护作用在延长恢复期后最为明显，这表明K845N赋予的益处可能是逐渐产生的，可能通过需要时间才能显现的增强DNA修复过程。与此一致，表达K845N的细胞也表现出降低的突变频率。支持这一观察在疾病背景下的相关性，杂合携带K845N变异体的亨廷顿病患者来源的淋巴母细胞样细胞系在甲萘醌诱导的应激恢复后显示出活力适度增加。总体而言，研究结果提供了证据，表明K845N可能通过增加连接保真度来增强基因组维持。重要的是，携带同源Lig1错义变异的Htt^Q111敲入小鼠在包括亨廷顿病中特别易受损的纹状体和皮质在内的多个组织中显示出CAG重复扩展显著减少。对扩展的影响是适度的；扩展在纯合Lig1^K843N/K843N小鼠中被显著抑制，在杂合Lig1^K843N/+小鼠中也呈现相同趋势。因此，从表面上看，小鼠中扩展抑制的程度可能不足以解释杂合携带此变异体患者中强大的疾病延迟效应。然而，由于临床发作是由体细胞扩展驱动的，而体细胞扩展发生在数十年的生命过程中，小修饰效应的累积影响可能是巨大的。确实，在10个月的小鼠期间，预计不会出现体细胞扩展的深刻减少。本研究仅检测了LIG1变异体对约100个CAG重复的体细胞扩展的影响，一个有趣的可能性是其效应可能取决于CAG长度，例如对体细胞扩展的慢速和快速阶段有不同的相对影响。有趣的是，尽管LIG1变异体修饰临床亨廷顿病表型，但最近一项关于亨廷顿病CAG重复在血液中扩展的全基因组关联研究并未在该位点识别出显著信号。这表明，与影响临床表型或血液CAG扩展而非另一方的其他几个位点一样，LI