《Biomass and Bioenergy》：Lactic acid bacteria in dark fermentation: From competitor to syntrophic partner for biohydrogen production from complex sugars
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本研究系统评估了不同还原糖组分及浓度对中温黑暗发酵产氢性能及微生物群落的影响，发现六碳糖系统产氢效率显著高于五碳糖（分别提升102.09%和60.25%），混合糖系统产氢损失不超过13.89%，并通过三维荧光光谱和微生物网络分析揭示乳酸菌与产氢菌协同机制。
赵子彤|丁杰|罗庚|赵宪|孙汉军|刘炳锋|庞继伟|任楠琪|杨珊珊
中国哈尔滨工业大学污泥安全处置与资源回收国家工程研究中心，哈尔滨，150090
摘要
预处理后的木质纤维素水解产物的暗发酵是生产可再生生物氢气的一种有前景的途径。然而，复杂的还原糖（RS）组成以及微生物群之间的代谢相互作用尚未得到解决。本研究系统评估了在不同浓度下，中温暗发酵过程中不同RS系统的生物氢气生产性能及微生物网络动态，旨在揭示氢气生产效率差异背后的微生物驱动因素。批次发酵实验表明，基于己糖的底物在氢气生产方面表现优于基于戊糖的底物，在3.5 g/L和20 g/L的浓度下分别多产生了102.09%和60.25%的氢气。在低浓度条件下（3.5 g/L），喂食半乳糖的组比喂食葡萄糖的组具有更高的氢气生产潜力，氢气产量增加了12.76%。此外，混合糖系统有效增强了戊糖的利用潜力，其氢气产量仅比纯己糖系统低6.46%-13.89%。值得注意的是，尽管在高RS浓度（20 g/L）下乳酸积累达到972.47 mg/L，但氢气产量从702.68 mL H2/L发酵液显著增加到2287.79 mL H2/L发酵液。三维激发-发射矩阵（3D-EEM）分析进一步显示，在20 g/L条件下，与腐殖质相关的荧光强度增强了41.98%。此外，微生物网络分析表明，乳酸菌通过与某些产氢细菌的协同作用对氢气生产效率有积极影响。这些发现将乳酸菌从传统的碳竞争者重新定义为产氢联合体中的协作参与者，突显了基于底物组成和微生物网络调节的策略在木质纤维素废弃物生物氢气生产中的潜力。
引言
通过中温暗发酵（DF）对木质纤维素生物质（LB）进行增值处理，为可再生生物氢气生产（BHP）提供了一条可持续的途径。然而，其效率受到木质素固有抗性和微生物代谢瓶颈的限制[1]。预处理和酶法糖化是LB BHP的关键前提，因为它们通过溶解木质素或半纤维素并释放RS来破坏基质，从而提高产氢微生物对底物的可利用性[2]。传统的预处理方法，如稀酸或碱水解，通常会产生抑制性副产物（例如糠醛、5-羟甲基糠醛和酚类化合物），其浓度超过1 g/L[2]。这些抑制剂会降低酶法水解效率30-50%，并影响发酵过程中的微生物活性[3,4]。例如，呋喃会不可逆地损伤微生物膜和脱氢酶，而酚类化合物会破坏氧化磷酸化过程，导致氢气产量比无抑制剂系统降低40-60%[5]。作为新兴的绿色溶剂，深共晶溶剂（DES）在保持可发酵糖的同时，显示出优异的LB选择性分级潜力[6]。最近在DES-酶系统方面的进展使得RS产量达到了约26.61 g/g玉米秸秆，比未经处理的玉米秸秆高出161.65%[7]。然而，DES衍生的水解产物具有复杂的糖谱，以己糖-戊糖混合物为特征，这与大多数研究中使用的人工葡萄糖/木糖二元底物明显不同[8,9]。这种差异对后续发酵至关重要，因为像阿拉伯糖和半乳糖这样的次要糖类，尽管在水解物中的总碳水化合物中占比不到20%，但显著影响BHP过程中的微生物群落功能。然而，大多数研究依赖于简化的糖系统，如葡萄糖或木糖，忽略了实际水解物中其他己糖和戊糖之间的协同或拮抗作用[10]。例如，阿拉伯糖在DES处理过的草类水解物中约占10%，但在92%的人工培养基设计中被排除在外，尽管有强有力的证据表明它在重新定向微生物代谢流中的作用[11]。这种过度简化使得糖组成和浓度梯度如何调节微生物网络动态和代谢途径选择机制仍不清楚，这对于将木质纤维素氢气生产技术从实验室推向工业应用至关重要。
因此，最近的研究开始探讨BHP系统中非葡萄糖/木糖糖类的代谢机制。胡等人[12]报告称，添加阿拉伯糖可以将醋酸丁酸梭菌的代谢从以丁酸为主导的途径转变为以乙酸为主导的途径，由于NADH/NAD+再生速率的变化，氢气产量降低了33%。同样，尽管半乳糖在典型水解物中占比不到5%，但在混合菌群中可增强胞外多糖（EPS）的合成，使碳流从氢化酶活性中分流[11,13]。这些发现突显了次要糖类对代谢分配的关键影响，但很少有研究系统评估三元或四元糖系统[11,[14],[15],[16]]。此外，糖组成、微生物网络稳定性和代谢副产物之间的相互依赖关系仍有待阐明。乳酸菌（LAB）是研究最多的微生物之一，因为它在不同的DF系统中表现出负面或正面效应。例如，LAB（如乳酸菌）在高葡萄糖浓度下增殖，降低pH值并通过底物竞争抑制梭菌等产氢菌[17,18]。网络分析显示，富含葡萄糖的系统比混合糖系统表现出更少的协同作用，这与氢气产量降低直接相关（R2 = 0.76）[19,20]。同样，Chatellard等人[21]发现戊糖可能是DF中的首选单体RS，其特征是乳酸产量低，从而导致梭菌在微生物群落中占主导地位，而基于己糖的组主要进行乳酸转化（>70%），这与氢气产量和丁酸合成减少相关。另一方面，在使用富含复杂碳水化合物的食品废弃物作为底物的DF系统中，LAB和产氢细菌的共存可以提高BHP产量。这些结果表明，不同类型的RS可能会影响LAB和产氢细菌之间的微生物网络。
本研究旨在通过系统评估使用深共晶溶剂衍生水解物的中温DF过程的BHP性能及相应的微生物响应，来填补这些空白。首先，本研究建立了两个浓度水平：低浓度3.5 g/L模拟不含葡萄糖的次要糖类组分的总浓度，高浓度20 g/L代表总糖浓度。系统比较了五种单一单糖及其等摩尔混合物的BHP性能。这种实验设计旨在捕捉两种实际情况，即总糖浓度的变化和均匀的糖组成。为了从微生物生态和代谢角度阐明BHP效率差异背后的机制，本研究结合了16S rRNA基因测序、三维激发-发射矩阵（EEM）光谱与并行因子分析（PARAFAC）以及氢气生产动力学建模。这种综合方法建立了发酵代谢物、功能性微生物和氢气生产速率之间的关联。此外，还利用微生物网络分析揭示了乳酸菌和梭菌之间之前被忽视的相互作用。基于乳酸分泌会降低pH值至5.0以下并富集耐酸梭菌种类的观察结果，本研究量化了糖组成如何调节这些种间相互作用。通过将糖浓度梯度与微生物代谢功能的稳定性联系起来，本研究提供了有助于构建稳定产氢菌群和优化深共晶溶剂预处理以保留关键还原糖的见解，从而推动可扩展的生物氢气生产技术的发展。
部分摘录
种子污泥
BHP实验所用的种子污泥来自中国哈尔滨市一家市政污水处理厂的二次沉淀池，然后长期用糖蜜废水进行驯化。在发酵前，驯化的污泥在90°C下进行热处理1小时，以选择性抑制产甲烷的古菌，同时保留产氢孢子形成菌。
批次培养中的BHP实验
批次发酵使用200 mL血清瓶进行。修改后的培养基总体积
生物氢气生产性能
为了评估复杂碳源对暗发酵产氢的影响，图1展示了发酵结束时的生物氢气产量、累积生物氢气生产曲线和代谢物曲线。值得注意的是，所有RS的消耗率均超过了98%，表明产氢污泥在培养阶段对多种还原糖具有很强的适应性（图S2）。
图1(a)和(b)记录了120小时内的累积BHP产量
结论
本研究表明，RS的组成和浓度对DF的效率和微生物网络的动态起着关键作用。基于己糖的底物（葡萄糖、甘露糖、半乳糖）在生物氢气产量方面始终优于基于戊糖的底物（木糖、阿拉伯糖），在3.5 g/L和20 g/L的浓度下分别多产生了102.09%和60.25%的生物氢气。特别是在低浓度条件下（3.5 g/L），喂食半乳糖的组表现出12.76%
CRediT作者贡献声明
赵子彤：撰写 – 审稿与编辑、方法学、数据分析。丁杰：撰写 – 审稿与编辑、验证、概念化。罗庚：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、数据分析。赵宪：数据管理、概念化。孙汉军：数据管理、概念化。刘炳锋：监督、项目管理、资金获取。庞继伟：监督、项目管理、资金获取。任楠琪：
利益声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者衷心感谢国家工程污泥安全处置与资源回收研究中心（哈尔滨工业大学，资助编号K2024A010）、中国黑龙江省的关键研究与开发项目（资助编号2022ZX02C14）以及城市水资源与环境国家重点实验室（哈尔滨工业大学）（编号2024TS03）的财政支持。
