利用靶向溶酶体的近红外荧光探针同时检测胰腺癌中的H?S和黏度

《Bioorganic Chemistry》：Simultaneous detection of H?S and viscosity in pancreatic cancer with a lysosome-targeted NIR fluorescent probe

本研究开发了一种近红外荧光探针TNSN-B，通过HClO特异性切割硼酸酯键释放荧光基团，实现胶质瘤术中精准导航。体外实验证实其可有效区分癌细胞与正常细胞，实时监测HClO；体内模型显示肿瘤边界荧光信号显著增强，60分钟达峰值，为提高手术成功率提供新工具。

　　

余伟|文珊|惠丁|刘国东|薛进|王小亮

南京大学医学院附属南京金陵医院神经外科，中国南京210002

摘要

胶质母细胞瘤是一种侵袭性极强的脑肿瘤，其边界不明确，这常常导致无法完全手术切除，从而预后较差。本文我们开发了TNSN-B，这是一种近红外荧光探针，可用于特异性检测次氯酸（HClO）并指导胶质母细胞瘤的手术。该探针通过HClO引发的硼酸酯键断裂反应释放TNSN荧光团，在588纳米处产生强烈的荧光信号。TNSN-B具有较大的斯托克斯位移（Stokes shift）、快速响应、高选择性、低细胞毒性和优异的生物相容性。体外实验表明，该探针能够有效区分癌细胞和正常细胞，并实时监测外源性和内源性HClO。此外，在皮下胶质母细胞瘤小鼠模型中的体内成像显示，注射后60分钟时肿瘤边界清晰可见，从而便于进行荧光引导下的切除手术。这些结果表明TNSN-B是改善胶质母细胞瘤诊断和精准手术的潜在工具。

引言

胶质母细胞瘤是一种高度侵袭性和致命性的原发性脑肿瘤，主要发生在中枢神经系统（CNS）[1]、[2]、[3]。该肿瘤发病隐匿、进展迅速、预后不良且复发率极高，是最恶性的原发性脑肿瘤类型。在临床肿瘤学中，早期诊断和精准治疗干预对于改善患者预后至关重要，准确定位肿瘤以提升生存率尤为重要[4]。最大程度地安全切除肿瘤组织（同时保护神经功能）已被证明可以显著延长胶质母细胞瘤患者的生存期。然而，保护神经功能同样对提高生存率具有重要意义[5]、[6]、[7]。

目前，胶质母细胞瘤的手术主要依赖术前成像技术，如计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）[8]和正电子发射断层扫描（PET）来评估肿瘤的大小和边界[9]。尽管这些技术在临床上有重要价值，但它们在提供实时术中反馈和准确反映肿瘤微环境内的动态生化变化方面存在局限性，尤其是在手术过程中明确浸润性肿瘤边界方面[10]。 基于荧光探针的生物成像技术因其高灵敏度、非侵入性、实时成像能力和优异的生物相容性而成为一种强大的替代方案[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。近年来，人们投入了大量精力开发针对胶质母细胞瘤相关生物标志物的荧光探针，包括单胺氧化酶（MAO）[16]、胆碱酯酶（ChEs）[17]、硫化氢（H₂S）[18]、半胱氨酸（Cys）[19]和活性氧（ROS）[20]。这类探针能够可视化肿瘤特定的生化活动，为改善肿瘤诊断、手术导航和治疗监测带来巨大潜力，从而可能提高患者的预后和生活质量[21]。

在各种活性氧中，次氯酸（HClO）因其独特的生物学功能和病理相关性而受到越来越多的关注。HClO主要由髓过氧化物酶（MPO）在活化中性粒细胞、巨噬细胞和小胶质细胞中催化过氧化氢（H₂O₂）和氯离子的反应生成[22]。在生理条件下，HClO受到严格调控，通常以纳摩尔浓度存在，通过有效清除入侵病原体发挥宿主防御作用。然而，在病理状态下，HClO的过量或失调产生（可达到微摩尔水平）会导致蛋白质、脂质和核酸的严重氧化损伤，最终促进组织损伤和疾病进展[23]。 越来越多的证据表明，异常的HClO生成与肿瘤微环境密切相关，尤其是在高度恶性和炎症相关的肿瘤（如胶质母细胞瘤）中。在胶质母细胞瘤病灶中，活化的小胶质细胞、浸润的中性粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞表现出增强的MPO活性，导致局部HClO生成增加[24]、[25]。升高的HClO水平被认为通过氧化应激介导的信号通路促进肿瘤侵袭、血管生成、免疫逃逸和治疗抵抗[26]、[27]、[28]。因此，HClO不仅被认为是炎症性肿瘤微环境的标志物，也是反映肿瘤侵袭性和进展的潜在生物标志物。

在本研究中，我们开发了TNSN-B，这是一种新型近红外（NIR）荧光探针，可用于特异性检测HClO并指导胶质母细胞瘤的手术。在未反应状态下，TNSN-B几乎不发光；与HClO反应后，硼酸酯部分选择性断裂，释放出TNSN荧光团，在588纳米处产生明显的荧光信号。TNSN-B具有较大的斯托克斯位移、快速响应、对HClO的高选择性和低细胞毒性，能够在活细胞中有效成像外源性和内源性HClO。更重要的是，该探针能够清晰地显示体内胶质母细胞瘤病灶，有助于在小鼠模型中进行荧光引导下的肿瘤切除，凸显了其在胶质母细胞瘤精准诊断和手术导航中的潜在价值。

材料与仪器

无需额外纯化处理，所有试剂和溶剂均按原样使用。薄层色谱（TLC）在硅胶板上进行。¹H和¹³C核磁共振（NMR）谱在Bruker Advance 400 MHz光谱仪上记录。紫外-可见光（UV–Vis）吸收测量使用Shimadzu UV-2550分光光度计（日本）进行。荧光光谱使用Hitachi荧光分光光度计（日本）获取。细胞成像在Zeiss Axio Observer A1显微镜上进行。

探针TNSN-B的设计与合成

TNSN-B的合成路线如图1所示。化合物1通过2-噻吩乙腈的溴化反应获得。随后，在催化剂Pd(PPh₃)₄的存在下，其与4-吡啶基硼酸 pinacol酯进行Suzuki偶联反应生成化合物2。化合物2再与4-(二苯氨基)苯甲醛进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物TNSN。最后，TNSN与4-溴甲基苯基硼酸 pinacol酯结合。

结论

总之，我们开发了TNSN-B这种新型近红外荧光探针，它可以特异性检测HClO并指导胶质母细胞瘤的精准手术。该探针通过与HClO的高选择性反应触发硼酸酯键断裂，释放出TNSN荧光团，在588纳米处产生强烈的荧光信号。由于具有较大的斯托克斯位移、快速响应和优异的生物相容性，TNSN-B表现出优异的性能。

CRediT作者贡献声明

余伟：撰写初稿、验证、方法学设计、概念构思。文珊：撰写、审稿与编辑、软件开发、数据分析。惠丁：资源获取、数据管理。刘国东：撰写、审稿与编辑、数据可视化。薛进：撰写、审稿与编辑、实验设计、概念构思。王小亮：撰写、审稿与编辑、项目监督、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。