《Bioorganic Chemistry》：Covalent targeting of PP2A scaffold subunit PPP2R1A by Pseudolarolide B enhances holoenzyme assembly to exert anti-inflammatory activity
编辑推荐：
假叶树碱B（PB）通过共价修饰蛋白磷酸酶2A（PP2A）的支架亚基PPP2R1A的Cys317，增强其与催化亚基C的相互作用，促进PP2A全酶组装及活性，从而抑制炎症信号通路磷酸化，发挥抗炎作用。
李玉彤|黄艳|王尚义|夏慧敏|李江|吴显福|卢勇|马波|苏国柱|李勇
中国医学科学院药物研究所天然药物生物活性物质与功能国家重点实验室，北京100050
摘要
伪罗拉里德B（PB）是一种从Pseudolarix amabilis（Nelson）Rehder中提取的螺环三萜内酯，具有显著的抗炎特性。然而，其抗炎作用的具体分子机制至今仍不清楚。本研究利用基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）技术，确定了蛋白质磷酸酶2A（PP2A）的支架亚基A（PPP2R1A）是PB的直接共价靶点。进一步研究发现，PB与PPP2R1A的Cys317位点发生共价结合。这种修饰增强了A亚基的结构稳定性，并提高了其招募催化亚基（C）和调节亚基（B）的能力，从而促进了活性PP2A全酶的组装并提高了其磷酸酶活性。结果，PP2A活性的增强导致关键炎症信号通路中的蛋白质去磷酸化。分子动力学模拟进一步证实了PB诱导的共价修饰稳定了PPP2R1A，并增强了其与催化亚基的相互作用。综上所述，本研究揭示了PB通过靶向其支架亚基来调节PP2A全酶组装和活性的新机制，为PP2A的药物治疗提供了新的策略。
引言
Pseudolarix amabilis（Nelson）Rehd在传统中医中被用于治疗皮肤病等疾病。P. amabilis的根皮和种子富含伪罗拉酸和伪罗拉里德三萜内酯。在之前的研究中，通过对P. amabilis种子中的三萜化合物进行活性筛选，发现伪罗拉里德B（PB）具有最强的抗炎活性（图1A）[1]。本研究确定了蛋白质磷酸酶2A（PP2A）的支架亚基PPP2R1A为PB的靶点。
蛋白质磷酸化是细胞信号传导中的核心调控机制，通过可逆修饰调节大约30%的哺乳动物蛋白质的功能活性。激酶和磷酸酶协同作用维持磷酸化平衡，这种平衡的破坏与多种疾病密切相关[2]、[3]。目前FDA已批准了80多种激酶抑制剂，但尚未有针对磷酸酶的药物获得批准[4]、[5]。与激酶明确的靶点机制相比，针对磷酸酶的药物开发亟需突破[6]、[7]。
PP2A是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，由支架亚基（A）、催化亚基（C）和调节亚基（B）组成[8]。这三个亚基的不同组合形成具有不同底物特异性和亚细胞定位的全酶。A亚基的高度结构灵活性促进了这种多样化的三聚体组装[9]。A亚基包含15个HEAT（huntingtin-elongation-A亚基-TOR）重复序列，这些序列连续连接形成“马蹄形”结构。A亚基通过HEAT重复序列11–15与C亚基结合，形成核心酶，随后招募各种B亚基构成活性异源三聚体全酶。PP2A全酶通过调节NF-κB和MAPK等通路中的关键信号节点来调控多种细胞过程，包括免疫和炎症反应[10]、[11]、[12]。PP2A全酶的催化亚基（C）包含负责去磷酸化的活性位点，对其酶活性至关重要。因此，C亚基一直是药物开发的主要目标。然而，由于C亚基在所有PP2A复合体中的高度保守性，针对C亚基的抑制剂往往选择性较低，可能导致PP2A多种细胞功能的广泛紊乱。
本研究证明，天然化合物PB通过特异性靶向PP2A的支架亚基PPP2R1A来发挥抗炎作用。PB与PPP2R1A发生共价修饰，改变了其构象动态，增强了其与催化亚基（C）和调节亚基（B）的结合亲和力。这种增强的相互作用促进了活性PP2A全酶的组装，显著提高了其磷酸酶活性。因此，PP2A活性的增强导致关键炎症通路中的信号分子去磷酸化，从而抑制了炎症反应。
化学试剂与材料
胎牛血清（FBS）购自Procell（中国）。超速离心管和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜来自Merck Millipore（美国）。高亲和力镍-硝基三乙酸（Ni-NTA）树脂购自GenScript（美国）。酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品缓冲液以及含有吐温20（TBST）的Tris缓冲盐水均来自相关供应商
伪罗拉里德B在结肠炎小鼠模型中的抗炎作用
为了研究PB的治疗潜力，我们首先在硫酸葡聚糖（DSS）诱导的溃疡性结肠炎（UC）小鼠模型中评估了其抗炎效果（图1B）。与正常小鼠相比，模型组小鼠的小肠明显缩短。HE染色显示肠绒毛扁平化、隐窝减少、细胞坏死脱落以及大面积水肿斑块。相比之下，接受抗炎药物柳氮磺胺（SASP）治疗的小鼠表现出
讨论
本研究表明，伪罗拉酸B（PB）通过迈克尔加成反应与PP2A支架亚基PPP2R1A的Cys317位点发生共价修饰。这种位点特异性的修饰增强了PPP2R1A的结构稳定性，提高了PP2A全酶的组装效率，并提升了其磷酸酶活性。在细胞水平上，这些变化伴随着多个炎症相关信号通路中磷酸化的协同降低
结论
总之，本研究阐明了伪罗拉里德B（PB）的抗炎作用机制。我们确定PP2A支架亚基PPP2R1A是PB的直接且功能相关的靶点，Cys317位的共价修饰增强了A亚基的结构稳定性，并加强了其与催化亚基C的相互作用。这种对PP2A全酶组装的别构增强作用
作者贡献声明
李玉彤：撰写初稿、数据可视化、实验设计。黄艳：数据可视化、实验设计、数据分析。王尚义：数据可视化、方法学设计、实验设计、数据分析。夏慧敏：数据可视化、方法学设计、实验设计、数据分析。李江：撰写初稿、审稿与编辑、数据分析。吴显福：撰写初稿、审稿与编辑、实验指导。卢勇：撰写初稿、审稿与编辑、实验指导。马波：撰写初稿、数据可视化、实验设计。苏国柱：撰写初稿
动物实验伦理批准与参与同意
动物实验的开展已获得中国医学科学院药物研究所动物护理与福利委员会的批准（批准编号：00008741）。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（批准编号：22377149）的资助。作者感谢中国医学科学院生物医学高性能计算平台的计算资源支持，并感谢首都医科大学核心设施中心的杨颖女士在生化实验中的技术协助。
