H2S供体萝卜硫素通过诱导线粒体自噬并减轻CBS-H2S轴的损伤，在帕金森病的体外和体内模型中抑制NLRP3炎性小体的激活

《Bioorganic Chemistry》：The H 2S donor sulforaphane inhibits NLRP 3 inflammasome activation by inducing mitochondrial autophagy and mitigating CBS-H 2S axis damage in in-vitro and in-vivo models of Parkinson's disease

氢硫酸（H?S）通过 CBS-H?S 信号轴发挥神经保护作用，硫普罗菲烷（SFN）作为 H?S 捐体可激活线粒体自噬清除受损线粒体，抑制 NLRP3 炎症小体和 caspase-1 通路，改善 MPTP 诱导的帕金森病小鼠运动功能及多巴胺代谢。研究发现 SFN 作用机制独立于 Nrf2 信号通路，为多靶点治疗帕金森病提供新策略。

　　

谢文宇|吴可|张琳|冯希宇|杨尚深|贾思宇|李玉彤|王晓明

山东中医药大学中医中药创新研究院，中国济南250355

摘要

硫化氢（H?S）在帕金森病（PD）中具有重要的神经保护作用。胱硫醚-β-合成酶（CBS）是参与H?S生物合成的关键酶，其表达缺陷与PD的进展密切相关。这表明，增强CBS–H?S信号通路以恢复H?S的稳态可能是预防和治疗PD的关键方法。在本研究中，我们探讨了H?S供体莱菔硫烷（SFN）通过激活CBS–H?S通路发挥神经保护作用的机制。通过siRNA介导的Nrf2和CBS沉默实验，阐明了它们在SFN作用中的作用。研究发现，SFN能够促进CBS的表达和H?S的合成，激活线粒体自噬清除受损的线粒体，降低线粒体衍生的活性氧（mtROS）水平，并抑制NLRP3炎性小体和caspase-1的活化。在MPTP诱导的PD小鼠模型中，SFN改善了运动表现，提高了黑质中酪氨酸羟化酶（TH）阳性多巴胺能神经元的存活率，并恢复了纹状体的多巴胺代谢，使DOPAC/DA和5-HIAA/5-HT比值恢复正常。电子显微镜观察显示，SFN通过自噬体促进了受损线粒体的清除，并阻断了mtROS介导的NLRP3炎性小体活化。在MPP⁺诱导的BV-2小胶质细胞模型中，SFN上调了CBS的表达，增强了H?S的合成，提高了LC3-II/I比值，并抑制了p62的降解，从而促进了线粒体膜电位的恢复并减少了ROS的释放。即使在Nrf2沉默条件下，这些效应仍然存在，表明SFN的神经保护作用是通过CBS–H?S通路独立于Nrf2信号通路实现的。总体而言，这些发现表明SFN重塑了CBS–H?S信号通路，激活了线粒体自噬，并抑制了炎症，为PD的多靶点治疗提供了新的见解，强调了H?S在神经保护中的重要作用。

引言

帕金森病（PD）是全球第二常见的神经退行性疾病。临床上，它表现为静止性震颤、肌肉僵硬、运动迟缓和姿势不稳等运动症状，以及认知衰退、情绪障碍和睡眠障碍等非运动症状[1]、[2]。从病理学角度来看，PD的特点是黑质致密部（SNpc）内多巴胺能神经元的进行性丢失、错误折叠的α-突触核蛋白在细胞内的聚集形成路易小体，以及小胶质细胞的持续过度活化[3]、[4]。后者导致促炎介质的过度释放，从而加剧神经炎症级联反应，加重神经元损伤，最终加速疾病进展[5]。

有充分的证据表明，NLRP3炎性小体的异常活化在维持PD的慢性神经炎症中起着关键作用[6]。线粒体功能障碍直接参与了这一过程，因为功能失调的线粒体会释放活性氧（ROS）、线粒体DNA（mtDNA）和其他损伤相关分子（DAMPs），这些都会增强NLRP3信号通路[7]。这种自我强化的炎症循环会加速神经退行性变[8]。线粒体自噬是一种专门用于清除受损线粒体的自噬形式，对于维持线粒体质量和细胞平衡至关重要[9]。研究表明，促进线粒体自噬可以下调NLRP3的活化，减轻神经炎症反应，并发挥神经保护作用[10]。因此，同时促进线粒体自噬和抑制炎性小体活化的治疗策略可能有助于减缓PD的进展。

H?S作为一种重要的内源性信号分子，因其神经保护作用而受到越来越多的关注。在中枢神经系统中，CBS是生成H?S的主要酶，对胶质细胞分化和神经元存活至关重要。H?S可通过上调抗氧化酶、限制ROS积累来减轻氧化应激，同时抑制小胶质细胞的过度活化及神经炎症[11]。此外，H?S支持多巴胺的合成，抑制有毒的α-突触核蛋白聚集，并通过S-硫化作用促进Parkin介导的线粒体自噬，从而清除受损线粒体并限制炎性小体的活化[12]、[13]、[14]。值得注意的是，在PD模型中，CBS表达减少和H?S生成受损意味着CBS–H?S通路的破坏可能会加重线粒体功能障碍和神经炎症，进而加速疾病进展[15]。

证据表明，CBS–H?S信号通路的破坏可能是帕金森病的一个关键问题，它通过将线粒体氧化还原失衡与持续的神经炎症联系起来，促进神经退行性变。在MPTP诱导的帕金森病模型中，内源性硫化物水平降低，同时纹状体和胶质细胞中的CBS表达选择性下调[16]。相反，恢复CBS表达可以增加硫化物的生成，减轻胶质细胞的活化，并部分逆转黑质-纹状体通路中的多巴胺能神经退行性变，同时改善运动功能障碍。CBS产生的H?S有助于维持线粒体氧化还原稳态，限制活性氧（mtROS）的积累，从而抑制小胶质细胞中的NLRP3炎性小体活化，这一炎症通路被认为是帕金森病慢性神经炎症的主要驱动因素[17]。此外，最近的研究表明，小胶质细胞中的CBS转录受炎症信号的动态调控，并与帕金森病相关的遗传通路功能相关，进一步强调了CBS在调节小胶质细胞炎症反应中的关键作用[18]。

尽管H?S供体具有显著的神经保护作用，但传统的无机形式如NaHS和Na₂S会以不受控制的方式迅速释放H?S，导致生物利用度短暂且可能存在毒性，这限制了它们的临床应用[19]。因此，人们开始关注能够持续释放H?S的天然化合物。异硫氰酸酯（ITCs），特别是来自十字花科蔬菜的SFN，因其能够缓慢释放H?S而成为有前景的候选物[20]。SFN具有良好的血脑屏障通透性，并具有多种神经保护作用，包括激活Nrf2通路、刺激线粒体自噬、抑制小胶质细胞驱动的神经炎症以及抗氧化和抗凋亡作用[21]。然而，鉴于SFN作为Nrf2激活剂的作用[21]，目前尚不清楚它通过CBS–H₂S信号通路调节线粒体自噬、抑制NLRP3炎性小体和缓解帕金森病相关神经炎症的作用主要是依赖于Nrf2信号通路，还是涉及Nrf2独立的机制。因此，明确SFN的作用机制对于阐明其神经保护作用以及为帕金森病多靶点治疗策略的开发提供理论基础具有重要意义。

在本研究中，我们探讨了SFN是否通过调节CBS–H₂S信号通路来增强线粒体自噬，抑制NLRP3炎性小体活性，从而减轻PD相关的神经炎症和神经元损伤。为了区分SFN效应中依赖于Nrf2和独立于Nrf2的机制，我们进一步采用了基因敲除方法，包括Nrf2单基因敲除和Nrf2/CBS联合缺陷，使用体外PD相关细胞模型。阐明这一调控网络可能为PD的多靶点干预提供新的见解，并强调CBS–H₂S通路在神经保护中的功能重要性。

试剂和抗体

本研究中使用的所有化学物质和试剂均来自认证的商业供应商。MPTP-HCl和MPP⁺碘化物购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（上海，中国）。莱菔硫烷、Na₂S、维生素C、DA、DOPAC、5-HT和5-HIAA购自Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.（上海，中国）。TNF-α和IL-1β的商用ELISA试剂盒购自Shanghai Yuanju Biotechnology（上海，中国）。细胞培养材料包括DMEM/F-12培养基等。

SFN改善了MPTP处理小鼠的运动功能缺陷

运动缺陷是PD的标志性特征，对于评估PD模型至关重要[23]。亚急性腹腔注射MPTP成功诱导了小鼠的PD样运动障碍。MPTP处理后，杆测试的潜伏期从对照组的4.7秒增加到12.0秒，而SFN或Na₂S处理后潜伏期减少了23–24%（图1B）。同样，在旋转棒测试中，MPTP处理后保留时间从326秒减少到137秒，SFN和Na₂S处理后部分得到了恢复。

讨论

PD的主要特征是黑质-纹状体通路中多巴胺能神经元的退化[36]。这种神经退化导致运动障碍，包括运动迟缓和步态异常。MPTP是一种常用于啮齿类和灵长类PD模型的神经毒素，它选择性地损伤多巴胺能神经元，触发神经元凋亡并模拟PD病理的关键方面。酪氨酸羟化酶是儿茶酚胺合成的关键酶，是确认PD的重要生物标志物。

结论

本研究确定SFN是一种新型的多靶点PD治疗候选物。SFN恢复了CBS介导的H₂S合成，通过线粒体自噬增强了线粒体质量控制，并抑制了NLRP3炎性小体驱动的神经炎症。这些发现为帕金森病的疾病修饰策略开发提供了坚实的基础。

CRediT作者贡献声明

谢文宇：撰写初稿、软件使用、数据管理、概念构思。吴可：验证、方法学设计、概念构思。张琳：概念构思。冯希宇：概念构思。杨尚深：方法学设计。贾思宇：软件使用。李玉彤：软件使用。王晓明：撰写、审稿与编辑、资金筹集。

资助

本工作得到了山东省自然科学基金（项目编号：ZR2024MH003, ZR2020QH323）、国家自然科学基金（项目编号：82003917）、中央政府支持地方科技发展引导资金（项目编号：YDZX2024027）、山东省高等学校青年创新人才培养计划（项目编号：2023KJ190）和中国博士后科学基金（项目编号：的支持。

未引用的参考文献

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利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。