耐碱盐的柴油降解菌株的表征 铜绿假单胞菌BDL及其在柴油污染土壤生物修复中的生物强化作用

《Bioresource Technology Reports》：Characterization of alkali-salt-tolerant diesel-degrading bacterial strain Pseudomonas aeruginosa BDL and its bioaugmentation for bioremediation of diesel-contaminated soil

柴油污染对土壤和公共健康构成威胁，本研究分离出耐碱盐菌株Pseudomonas aeruginosa BDL，基因组分析显示其携带alkB、adhP等关键石油烃降解基因，在pH9、20g/L NaCl条件下仍能72.02%降解柴油污染物。土壤生物强化实验表明该菌株成功定殖并提升柴油降解效率，PICRUSt分析揭示其富集烷烃降解基因，微生物群落结构也发生显著变化，Proteobacteria丰度增加且Alcanivorax成为优势菌。

　　

Xuwang Zhang | Huimin Li | Dongli Bao | Minghuo Wu | Hao Zhou | Yuanyuan Qu | Jingjing Zhan

大连工业大学化学工程、海洋与生命科学学院，盘锦，124221，中国

摘要

柴油污染对土壤和公共健康构成了严重威胁。微生物修复因其环保优势而受到重视，这需要分离出能够有效降解柴油的菌株，尤其是在盐碱条件下。在本研究中，分离出一种耐碱盐的菌株Pseudomonas aeruginosa BDL，并证明了其降解柴油、原油和石油烃的强大能力。基因组分析发现了多种降解烃的基因，包括alkB、adhP和ALDH，使其能够有效生物降解柴油污染物。BDL菌株在盐碱条件下表现出中等的耐受性，在pH值为9、NaCl浓度为20 g/L、柴油浓度为0.5%（体积比）的条件下，可去除72.02%的石油烃。生物强化实验表明P. aeruginosa BDL显著增强了土壤中的柴油去除效果。高通量测序显示，柴油污染降低了微生物多样性和丰富度。在柴油胁迫下，变形菌门（Proteobacteria）的丰度显著增加，其中Alcanivorax成为生物强化组和对照组中的优势属。此外，Pseudomonas成功定殖在土壤中，对生物强化群落贡献了5.69%–6.81%的生物量。PICRUSt分析表明，生物强化过程增强了烷烃降解基因的表达，可能提高了柴油的生物降解效率。本研究突出了P. aeruginosa BDL作为石油污染土壤生物修复的有希望的微生物资源，并为其在环境修复中的应用提供了实用见解。

引言

石油是重要的能源和化工原料，在全球经济中发挥着关键作用。其衍生物如柴油被广泛用于工业和日常生活。柴油主要用作重型车辆、船舶和发电机的燃料，含有饱和烃和芳香烃以及非烃类物质。其主要成分是碳链长度在10到25之间的复杂烃类（Imron等人，2020年）。然而，使用、运输和加工过程中的监管不足和不当处理可能导致环境污染。2020年，超过21,000吨柴油泄漏到环境中（Sulbaran-Bracho等人，2023年）。柴油在土壤和水体中的泄漏会引入过量的有机碳和有毒化合物，对生态系统和生物构成严重威胁。柴油中的持久性烃类需要有效去除以减轻这些环境风险。生物修复，特别是微生物降解，被广泛认为是处理土壤中柴油污染的环保方法（Imron等人，2020年）。

微生物降解的重点是分离和鉴定能够高效降解柴油污染物的菌株。包括细菌、放线菌、真菌、酵母和藻类在内的多种微生物已被证明具有降解烃的能力（Varjani，2017年；Silini等人，2022年；Horel和Schiewer，2020年）。其中，细菌在降解柴油污染物方面尤为有效。例如，从受油污染的土壤中分离出的Acinetobacter KJ-1菌株在12天内降解了超过40%的柴油（Zhang等人，2022年）。Serratia Tan611菌株在72小时内降解了原油中73.77%的直链烷烃（Semai等人，2021年）。然而，高效降解柴油的细菌菌株仍然有限，尤其是在盐碱条件下表现可靠的菌株更为稀缺。这是一个主要限制，因为高盐度和pH值在受污染的地点（如沿海盐碱化土壤、油田和受工业排放或除冰盐影响的区域）很常见。此外，降解效率受污染物特性、微生物种类、pH值、温度、盐度和养分可用性等因素的影响（Varjani和Upasani，2017年；Khalid等人，2021年；Arenas Soler等人，2025年）。其中，盐度和pH值尤为重要，因为它们会通过改变细胞稳态、酶功能和养分可利用性来抑制微生物的生长和活性（Imron等人，2020年；Hazaimeh和Ahmed，2021年）。因此，这些压力因素常常限制了生物修复的现场应用。因此，有必要系统评估微生物在不同盐碱条件下的耐受性和降解效率，以识别出具有强能力的候选菌株并优化处理流程。针对盐碱限制的针对性研究对于改善实际环境中的柴油生物修复至关重要。

生物强化是一种将专门的细菌菌株添加到污染地点的方法，已被证明可以增强污染物的去除效果（Zhang等人，2021b；Nwankwegu等人，2022年）。然而，接种菌株的长期持久性仍存在争议。生物强化已被证明可以改善受油污染土壤的修复效果。例如，Ghaedrahmat等人（2022年）证明，添加能够降解石油烃的细菌群落可以显著提高土壤中石油烃的去除率。Yang等人（2023年）发现，将Pseudomonas TF1菌株接种到受柴油污染的土壤中，14天内柴油去除率从15%增加到55%，尤其是对于高分子量烷烃（C20至C26）。因此，高效降解柴油的菌株在污染地点的成功定殖和存活可能为柴油去除提供一种实用策略。

在我们之前的研究中，从以石油烃为唯一碳源的受原油污染土壤中富集了耐碱盐的微生物群落（Zhang等人，2021a）。高通量测序显示Pseudomonas、Stenotrophomonas、Achromobacter、Mesorhizobium和Brucella是这些群落中的优势属，表明它们具有降解柴油的潜力。基于之前的发现，本研究旨在从耐碱盐的群落中分离出高效的柴油降解细菌，表征其生长和降解能力，并评估其在受柴油污染土壤中的生物强化潜力。本研究的目标是为柴油污染地点的生物修复提供有价值的细菌资源，并评估生物强化作为一种高效修复策略的可行性。

部分摘录

化学物质和培养基

本研究中使用的柴油来自中国盘锦的一家当地加油站，并通过过滤进行灭菌。石油烃混合物（C10-C25，每种成分1000 μg/mL，溶于己烷）购自Aladdin Scientific Corp.（上海，中国）。所有其他化学物质和试剂均为分析级或更高级别。用于菌株筛选和生物降解实验的Bushnell-Haas（BH）培养基（pH值7.0–7.2）含有1 g/L KH₂PO₄、1 g/L K₂HPO₄、1 g/L (NH₄)₂SO₄和0.2 g/L MgSO₄。

柴油降解菌株的分离及其基因组特征

从受原油污染土壤中富集的微生物群落中分离出一种柴油降解菌株BDL。该菌株能够在多种石油污染物上生长，包括正癸烷、正十二烷、正十六烷、柴油和原油（图1a）。BDL菌株在固体培养基上的菌落呈圆形、规则、凸起、湿润且光滑。扫描电子显微镜（SEM）显示BDL为杆状，表面有皱纹，长度约为1 μm（图1b）。基于16S rRNA基因的系统发育分析...

结论

本研究证明耐碱盐的P. aeruginosa BDL是一种有前景的柴油降解菌株。基因组分析揭示了关键的烃降解基因（如alkB和adhP），与其在恶劣条件下的强降解性能一致，在pH值为9、NaCl浓度为20 g/L的条件下可去除72.02%的柴油。土壤生物强化实验进一步支持了其实际效果，显示出污染物的有效去除以及成功的定殖和...

CRediT作者贡献声明

Xuwang Zhang：撰写——初稿、可视化、监督、资金获取、概念构思。 Huimin Li：可视化、研究、数据分析。 Dongli Bao：撰写——初稿、方法学、研究、数据分析。 Minghuo Wu：验证、方法学。 Hao Zhou：撰写——审稿与编辑、资源协调。 Yuanyuan Qu：资源协调、项目管理、概念构思、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：42277108）、辽宁省自然科学基金（编号：2024-MSBA-25）和中央高校基本科研业务费（编号：DUT25LAB201）的财政支持。