基于铬-三聚氰胺纳米酶的侧向流动免疫分析法用于转谷氨酰胺酶2的灵敏与选择性检测：面向肝癌相关生物标志物评估的概念验证

《Biosensors and Bioelectronics》：Chromium–Melamine Nanozyme-Enhanced Lateral Flow Immunoassay for Sensitive and Selective Detection of Transglutaminase 2: Proof-of-Concept toward Liver Cancer–Related Biomarker Evaluation

CrN@MDC纳米酶复合物集成到LFA中，实现TGM2检测下限0.025 nM，灵敏度较传统AuNP方法提升40倍，并验证其在血浆样本中的有效性和一致性。

　　

作者：Mungyeong Jeong、Mulya Supianto、Gyudong Lee、Sung Hwa Jhung、Chelladurai Karuppiah、Hye Jin Lee

韩国庆北国立大学化学系与绿色纳米材料研究中心，大邱市 Buk-gu 区 Daehakro 80 号，41566

摘要

本文开发了一种基于 Cr₂O₃-melamine@MAF-6 的碳纳米酶复合材料（CrN@MDC），并将其应用于侧向流动分析（LFA）技术中，用于临床血浆样本中转谷氨酰胺酶 2（TGM2）的灵敏且特异的定量检测。TGM2 是肝癌的潜在生物标志物。合成了不同 Cr₂O₃ 含量的 CrN(x)@MDC 纳米酶（x = 0、0.05、0.10 和 0.15），并通过 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）/H₂O₂ 色度反应评估了它们的过氧化物酶活性，结果表明 CrN(0.10)@MDC 具有最高的催化活性。基于 CrN(0.10)@MDC 的 LFA 通过纳米酶催化 TMB 的氧化产生明显的黑蓝变色信号，能够在缓冲液和血浆中检测到低至 0.025 nM 的 TGM2 浓度。与传统基于金纳米粒子的 LFA 相比，其视觉检测灵敏度提高了约 40 倍。此外，该检测方法在血浆基质中的检测限低（0.0095 nM），并对丰富的血浆蛋白、相关生物标志物及肝病相关干扰物具有高选择性，这可能归因于使用了牛血清白蛋白对纳米酶表面的有效阻断。对健康个体和肝癌患者的未稀释临床血浆样本的直接分析显示，使用所提出的 LFA 测得的 TGM2 浓度与商业酶联免疫吸附测定（ELISA）的结果一致。这些结果证明了纳米酶增强型 LFA 作为临床相关 TGM2 检测的概念验证平台的适用性。

引言

酶在生物催化中起着核心作用，由于其高特异性和催化效率，长期以来被用于生物传感和诊断检测（Ashrafi 等，2021）。尽管酶被广泛使用，但天然酶通常存在生产成本高、操作稳定性有限以及对温度和 pH 等环境条件敏感的问题，这些限制了其在即时诊断（POC）平台中的实际应用（Gupta 等，2022；S. Y. Liu 等，2025）。这些局限性促使人们开发了人工酶模拟物，特别是纳米酶——这类纳米材料具有类似酶的催化活性，包括过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶、氧化酶和水解酶功能（Kuah 等，2016；Y. Zhang 等，2024）。由于纳米酶具有优异的稳定性、低成本和可调的催化性质，它们已成为生物传感、免疫分析和疾病诊断的可靠替代品（Wu 等，2019）。其中，含有 Fe、Pd、Ce 和 Cu 等元素的金属基纳米酶尤其具有吸引力，因为它们具有强氧化还原活性和信号放大效果（Fu 等，2024）。这些纳米酶已成功集成到电化学、化学发光和色度生物传感平台中，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）和侧向流动分析（LFAs），从而提高了分析灵敏度和可靠性（Kurup 和 Ahmed，2023；Li 等，2022；Z. Liu 等，2025；Soh 等，2020；Zhang 等，2019）。 LFAs 是最常用的 POC 诊断工具之一，因为它们简单、响应迅速且成本低（Raeisossadati 等，2016）。然而，传统的 LFA（通常基于金纳米粒子（AuNPs）往往灵敏度和定量能力有限，尤其是在检测低丰度生物标志物时（Nguyen 等，2020）。为了解决这些问题，人们广泛探索了基于纳米材料的信号放大策略。例如，Wang 等人报道了一种 Au@CeO₂ POD 模拟纳米酶，该纳米酶能在过氧化氢（H₂O₂ 存在下催化 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）的氧化，实现了 0.35 ng/mL 的检测限（H. Wang 等，2024）。类似地，具有 POD 活性的 Au@Pt 和 Fe₃O₄ 纳米酶也被用于基于 LFA 的病毒 DNA 目标（如 H1N1）的检测，突显了纳米酶增强型 LFA 在敏感诊断中的潜力（K. Wang 等，2024）。最近的研究进一步扩展了用于生物传感应用的金属基纳米酶的范围，包括基于 Pd、Ir、Cu 和 Ce 的系统（Kong 等，2022；Liang 等，2022；Meng 等，2023；Zhu 等，2024）。然而，基于铬（Cr）的纳米酶在 LFA 信号放大方面的应用仍较少。 早期检测肝癌仍然是一个重大临床挑战，因为该疾病在晚期诊断时的死亡率和预后较差（Sung 等，2021）。基于生物标志物的策略为改善早期诊断和治疗结果提供了有希望的途径（Gao 等，2020；Ma 等，2025）。在报道的生物标志物中，转谷氨酰胺酶 2（TGM2）因其在肝癌患者中的表达升高而受到越来越多的关注（Sun 等，2008）。在本研究中，我们报道了一种基于氮化铬纳米酶（CrN@MDC）的纳米酶增强型 LFA，用于临床血浆样本中 TGM2 的灵敏检测。CrN@MDC 纳米酶具有内在的 POD 类活性，在 H₂O₂ 存在下催化 TMB 的氧化，产生明显的色度信号。经过 MAF-6 前体的热解后，所得纳米酶表现出增强的催化活性和有利于抗体结合的表面特性（Abul Hossain 和 Jhung，2024）。CrN@MDC 纳米酶被集成到 LFA 格式中，并与检测抗体结合，从而实现对 TGM2 的选择性识别，测试（T）线的信号强度与分析物浓度定量相关。所提出的基于 CrN@MDC 的 LFA 的分析性能经过了系统评估，并与传统的基于 AuNP 的 LFA 进行了对比，显示出显著提高的灵敏度和诊断准确性。本研究强调了 CrN@MDC 在 LFA 信号放大方面的未开发潜力，并提出了一种可用于检测肝癌相关生物标志物的 POC 生物传感策略。

实验部分

纳米酶合成、表征、酶活性测试、LFA 性能测试、血浆样本分析和 ELISA 验证测试的详细信息见电子支持资料。

CrN(x)@MDC 增强型 LFA 的检测策略

纳米酶增强型 LFA 的制备流程和检测原理如图 1 所示。CrN(x)@MDC 纳米酶是通过 (Cr₂O₃-melamine)@MAF-6 复合材料的高温热解合成的，其中 x 表示合成过程中使用的 Cr₂O₃ 前体的初始质量（x = 0、0.05、0.10 和 0.15 g），具体细节见支持实验部分和图 S1。在合成的 CrN(x)@MDC 材料中，选择了 x = 0.10 的组成用于传感器开发。

结论

在本研究中，我们开发了一种基于 CrN(0.10)@MDC 的 LFA，用于人体血浆中 TGM2 的灵敏和选择性检测。优化后的纳米酶在 Cr₂O₃ 含量为 0.10 g 时表现出高 POD 类催化活性，具有良好的动力学参数（K_m = 0.29 mM 和 V_max = 47.17 μM min^?1），从而实现了高效的催化信号放大。结果表明，使用 2.0 M H₂O₂ 和 41.6 mM TMB 的 CrN(0.10)@MDC 基 LFA 能够检测到低至 0.025 nM 的 TGM2。

CRediT 作者贡献声明

Hye Jin Lee：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。 Mungyeong Jeong：撰写 – 初稿撰写、实验研究、数据管理。 Gyudong Lee：实验研究、正式分析、概念构思。 Mulya Supianto：撰写 – 初稿撰写、实验研究、数据管理、概念构思。 Chelladurai Karuppiah：撰写 – 审稿与编辑。 Sung Hwa Jhung：撰写 – 审稿与编辑、资源提供。

未引用参考文献

Liu 等，2025；Liu 等，2025；Wang 等，2024；Zhang 等，2024。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本项目得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，资金来源于韩国政府（科学技术信息通信部，MSIT）（授权号：RS-2023-00207831 和 RS-2024-00343620）。该项目还得到了区域创新系统（RISE）Glocal University 30 项目的部分支持，该项目通过大邱 RISE 中心实施，资金来自教育部和大邱市（2025-RISE-03-001，资助对象为 C. Karuppiah）。本研究中使用的所有生物样本和数据均...