《Biosensors and Bioelectronics》：In-incubator continuous and endpoint monitoring of angiogenesis using a chip-sized holographic microscope
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本研究聚焦传统活细胞成像依赖培养箱外笨重光学显微镜、通量低、长期监测困难的问题。研究人员开发了一种用于孵化器内实时监测血管生成（Angiogenesis）的芯片级、紧凑、可扩展、低成本的无透镜数字全息显微镜（CSM），并在VEGF诱导的HUVECs（人脐静脉内皮细胞）管形成实验中进行了验证。该设备可对血管网络的形态变化进行连续、无标记的量化，捕获了VEGF的剂量依赖性效应及血管网络的完整时程演化，其结果与常规显微镜数据高度一致。这为细胞水平生物传感、药物筛选和基于细胞的分析提供了一个实用平台。
在生命科学和药物筛选领域，持续监测细胞间的相互作用和多细胞网络的动态变化至关重要。无论是进行原位生物传感、药物筛选还是基于细胞的分析，研究人员都需要观察活细胞如何生长、迁移、自组织形成复杂结构。然而，长期以来，科学家们面临一个棘手难题：常规的活细胞成像依赖于放置在细胞培养箱之外的大型光学显微镜。这意味着每次观察都需要将珍贵的细胞样品从稳定、适宜的培养环境（恒温、恒湿、恒CO2浓度）中取出，这个过程不仅通量低、耗时费力，更关键的是，会扰乱细胞所处的微环境，影响其生理状态，使得长期、低扰动的实时监测变得异常困难。此外，那些能够整合到培养箱内的商业显微镜系统又往往价格昂贵，且不便进行多设备并行监测，限制了大规模平行实验的开展。为了攻克这些瓶颈，研究人员一直在寻找更紧凑、更经济、可扩展，并且能够直接放在标准CO2培养箱内工作的成像解决方案。
为了解决上述问题，一支研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》期刊上发表了一项研究，他们成功开发并验证了一款芯片大小的无透镜数字全息显微镜。这项研究旨在评估该设备作为定量、原位监测血管生成分析的实用平台的潜力。为此，研究人员利用血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）诱导的原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）管形成实验这一经典的体外血管生成模型，对芯片级全息显微镜进行了系统性的验证。他们比较了该设备与传统倒置显微镜在终点分析中的表现，并首次利用该设备在培养箱内对血管网络的完整时程动态进行了连续成像。
研究人员开展这项研究主要依赖于几个关键技术方法。首先是芯片级全息显微镜本身的设计与实现。该设备采用CMOS传感器和微LED阵列的直列全息构型，样品放置在两者之间固定的10毫米距离内，无需透镜、针孔或分束器等光学元件。其紧凑的铝制外壳使其可放入标准CO2培养箱。通过外部USB控制电源开关模块，仅在采集图像时短暂通电，有效控制了设备工作产生的热量，确保了培养箱内的热稳定性，温度波动可控制在±0.5°C以内。其次是图像获取与数值重建。图像采集通过自定义的基于Python的软件接口控制，包含定时、单次和实时视频模式。采集到的原始强度全息图通过数值后向传播和孪生像抑制算法进行重建，生成高对比度图像。最后是血管网络分析。研究人员通过半自动化的Python流程，对重建图像进行处理，基于色调-饱和度-明度阈值和形态学操作提取了关键的定量血管网络形态学指标，包括总管长度、节点数量、网眼数量以及平均网眼面积。
3.1. 终点血管生成分析
该部分通过终点实验验证了芯片级全息显微镜定量分析血管生成的能力，并考察了VEGF的剂量依赖性效应。
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成像对比：研究人员在24小时时间点，使用芯片级全息显微镜和传统倒置显微镜，对0、20、40、50 ng/mL四种VEGF-165浓度处理的HUVECs样品进行了成像。重建后的图像清晰地捕捉到了与常规显微镜观察到的相同网络结构。从图像中可以提取出用于定量分析的要素，包括管道、网眼和连接点。
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定量结果：对六个生物学重复的定量分析显示，芯片级全息显微镜能够解析VEGF剂量依赖性的血管形态变化。在20和40 ng/mL VEGF浓度下，总管道长度和连接点数量相比对照组有所增加，表明内皮细胞连接性增强。而暴露于50 ng/mL VEGF时，总管道长度和连接点数量均下降，表明血管网络结构发生了破坏。芯片级全息显微镜成功捕获了20-40 ng/mL的VEGF增强阶段以及50 ng/mL时的血管回归趋势。平均网眼面积则随VEGF浓度增加而减小。
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检测限与动态范围：研究定义了形态学检测限和形态学动态范围。形态学检测限被定义为在实验条件下可被可靠分割的最小网眼面积，本研究中计算为1383 μm2。形态学动态范围是最大VEGF诱导网眼面积与形态学检测限的比值，为1643。
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与传统显微镜的比较：对四种条件下的定量指标进行比较，发现芯片级全息显微镜测量的总管道长度、连接点数量与传统倒置显微镜的结果高度一致，差异分别小于5%和3%。两种方法测得的平均网眼面积差异也极小。对个体网眼面积的比较显示出强线性相关性，进一步证实了两种成像方法在量化血管网络形态方面的一致性。
3.2. 连续血管生成监测
在验证了终点分析能力后，研究人员利用芯片级全息显微镜对40 ng/mL VEGF条件下的血管生成过程进行了连续、时间推移的成像，以捕获其动力学演化。
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时程成像：在18小时内，每30分钟采集一次图像。代表性图像显示，血管网络随时间推移逐步形成、扩展和重塑。两批独立的重复实验均显示出相似的时间演化模式。
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动力学分析：对0至18小时的数据分析显示，总管道长度在约6小时达到峰值，随后逐渐减少，这与体外内皮网络随时间的自然成熟和重构过程一致。连接点数量也呈现相似的先增后减的模式。而平均网眼面积在整个实验过程中持续增加，这反映了由于管道变薄、断裂以及相邻网眼合并所导致的封闭区域扩大。尽管存在实验间的变异性，但两次独立实验都显示了相同特征的血管形成动力学模式，即先增长后消退。
综合来看，本研究的结论和讨论部分指出，芯片大小的全息显微镜是一个用于体外血管生成分析的、有效、定量的成像平台。它成功地在标准内皮管形成实验中重现了VEGF的非线性剂量反应，能够捕捉到中间浓度的促血管生成效应和更高浓度下的网络结构破坏效应。在终点实验中，其定量结果与传统倒置显微镜高度一致，为基于形态的网络指标作为无标记读出提供了支持。在连续成像中，该设备成功解析了从早期扩张到晚期网络重塑的完整时程，这揭示了传统终点分析无法获取的动力学信息，例如网络复杂性达到峰值的时间和消退速率，这使得芯片级全息显微镜能够作为一个成像生物传感器，在同一个平台上桥接连续功能监测和终点分析。
与现有的无透镜数字全息显微镜和商业培养箱内成像系统相比，芯片级全息显微镜具有多个显著优势。其紧凑、低成本的模块化设计可直接放入标准CO2培养箱，无需笨重的显微镜或专用环境控制腔室。其低功耗和热稳定特性允许多个设备在单个培养箱内并行运行，有望实现高通量的血管生成或多条件筛选研究。从生物传感的角度看，利用从重建图像中稳健提取的、与VEGF剂量反应趋势一致且与传统显微镜数据具有定量可比性的血管网络形态参数，验证了该设备作为血管生成成像生物传感实用平台的潜力。当然，该研究也存在一些局限性，如当前空间分辨率针对网络级形态而非亚细胞特征，分析流程可进一步自动化，并且研究聚焦于单一细胞类型、单一刺激因子和有限的浓度范围。未来的工作可以扩展到更广泛的促血管和抗血管生成剂，或将该设备与微流控和器官芯片系统集成，以支持更复杂的血管模型研究。总体而言，这项研究证明了芯片级全息显微镜为监测血管生成提供了一个紧凑、经济、低扰动的有效工具，并为细胞分析、药物筛选和疾病建模领域的动态、无标记、高通量生物传感开辟了新途径。
